赵咏中，方玉鹏，王建军，董 伟，许开云

（武威市畜牧兽医科学研究院，甘肃武威 733000）

湖羊布鲁氏菌S2疫苗免疫血清抗体消长规律研究

赵咏中，方玉鹏，王建军，董 伟，许开云

（武威市畜牧兽医科学研究院，甘肃武威 733000）

目的探究湖羊经布鲁氏菌S2疫苗免疫后的血清抗体消长规律。方法采用皮下注射25亿CFU（正常剂量）、口服免疫100亿CFU（正常剂量）、口服免疫150亿CFU（1.5倍剂量）3种免疫方法，对试验湖羊进行S2疫苗接种。在免疫前后的不同时间点，采集血液，分离血清，通过虎红平板凝集试验（RBT）和试管凝集试验（SAT）检测血清抗体水平。结果皮下免疫组在免疫后7 d出现抗体，21 d达到峰值，平均抗体效价最高为1:400，RBT和SAT抗体阳性率均为100%；免疫后120 d，RBT、SAT血清抗体阳性率分别为53%、56%；血清抗体存续时间为240 d。1.5倍剂量口服组免疫后21 d，RBT、SAT抗体阳性率分别为80%、83%，平均抗体效价最高为1:230.9，血清抗体存续时间为150 d。正常剂量口服免疫组在免疫后14 d产生抗体，21 d的抗体阳性率最高，RBT、SAT抗体阳性率分别为50%、57%，平均抗体效价最高为1:156，血清抗体存续时间为120 d。结论布鲁氏菌S2疫苗皮下免疫效果明显优于口服免疫效果，但可能存在免疫副反应；1.5倍剂量口服优于正常剂量口服。

布鲁氏菌病；S2疫苗；血清抗体；持续时间；湖羊

Abstract：[Objective]TO investigate the dynamic changes of serum antibodies in Hu-sheep immunized with brucellosis vaccine (S2). [Methods] Three different methods were used to vaccinate the Hu-sheep：oral immunization of 10 billion CFU（normal dosage），oral immunization of 15 billion CFU（normal dosage），and subcutaneous injection of 2.5 billion CFU（1.5 times than normal dosage）. Then serum samples were collected in different timepoints before and after vaccination and detected by Rose Bengal plate agglutination test（RBT）and tube agglutination test（SAT）. [Results] After subcutaneous injection，the antibodies could be detected on 7th day，and the peak value appeared on 21st day. During this period，the average highest antibody titer was 1:400，and the positive rates of antibodies detected by RBT and SAT were both 100%，while the positive rates of antibodies tested on 120th day were 53% and 56% respectively；The serum antibodies lasted for 240 days. For oral immunization of 1.5 times dosage CFU，on 21st day after dosing，the antibody positive rates by RBT and SAT detection were 80% and 83% respectively；The average highest antibody titer was 1:230.9；The serum antibodies could lasted for 150 days after dosing. After oral immunization of oral dosage CFU，the antibodies appeared on 14th day，then rose up to the highest level on 21st day；The positive rates of antibodies detected by RBT and SAT were 50% and 57%，and the average highest antibody titer was 1:156；At last，the serum antibodies could last for 120 days.[Conclusion] The immune effect of subcutaneous injection method was obvious better than that of oral route，however，side-effects could be found during subcutaneous injection. Other side，effect of oral immunization of 1.5 times dosage cfu was better than the normal dosage oral medication.

Key words：Brucellosis；vaccine of S2 strain；serum antibody；duration；Hu-sheep

布鲁氏菌病（以下简称布病）是由布鲁氏菌属细菌引起的一种人兽共患变态反应性传染病[1]。羊种布鲁氏菌能够引起怀孕母羊流产，公羊发生睾丸炎等，是引起人布病感染的主要菌型，给畜牧业发展和人类健康带来严重危害[2]。我国将布病列为二类动物疫病，并列入《国家中长期动物疫病防治规划（2012—2020年）》重点防控疫病名录[3]。当前，我国布病控制措施主要以检疫净化为主，在重点疫区对易感动物接种疫苗。目前用于动物布病防控的弱毒活疫苗主要包括猪种S2疫苗、牛种S19疫苗、羊种M5疫苗、羊种Rev.1疫苗和粗糙型牛种RB51疫苗等。20世纪70年代，猪种S2疫苗正式用于羊的免疫。S2疫苗具有适用范围广、使用方便、毒力较S19弱等优点，适用于猪、牛、山羊、绵羊等多种动物的免疫[4]。

目前，一些地区S2疫苗的防治效果不甚理想。S2疫苗为光滑性菌株，其LPS中的O抗原刺激机体产生的抗体会干扰常规血清学诊断，无法鉴别疫苗接种动物和自然野毒感染动物[5-6]，只能通过疫苗存续时间来鉴别[7-8]。此外，关于羊S2疫苗免疫抗体存续时间的报道也不尽相同。为进一步探究湖羊免疫S2疫苗后的抗体消长规律，本试验设计不同免疫途径进行S2疫苗接种，以RBT、SAT方法进行免疫血清抗体检测，从而了解和掌握湖羊S2疫苗的免疫效果、抗体消长规律和疫苗副作用等，为S2疫苗免疫程序的制定、免疫方法的优化提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物

共120只4～5月龄湖羊。在免疫前对所有试验羊进行RBT和SAT检测，检测结果均为阴性。将试验羊随机分为4组，每组30只，分别为皮下免疫组、口服免疫1组、口服免疫2组、空白对照组。对试验羊均打耳标标记，在相同生产条件下饲养管理。

1.2 试验疫苗

布病活疫苗（S2株）（产品批号1608016），为中牧实业股份有限公司兰州生物药厂生产。疫苗保存于4 ℃冰箱，使用时恢复到室温条件，然后用生理盐水稀释，使用专用连续注射器口服或皮下注射。

1.3 检测试剂

布病虎红平板凝集试验抗原（批号160010601）、试管凝集试验抗原（批号160010801）、阳性对照、阴性对照（20160501）均购自青岛易邦生物工程有限公司。各检测试剂均在有效期内使用。

1.4 疫苗接种方法

对3组试验羊隔离饲养，分别采用口服和皮下注射2种方法进行S2疫苗免疫接种。根据疫苗使用说明书，设正常剂量和1.5倍剂量。皮下免疫组（正常剂量），每只羊免疫25亿CFU；口服免疫组（正常剂量），每只羊免疫100亿CFU；口服免疫组（1.5倍剂量），每只羊免疫150亿CFU。空白对照组不免疫。

对免疫后试验羊的临床表现、体温、饮食等进行观察和记录，用于评价S2疫苗不同剂量及不同免疫途径对羊的疫苗副作用。

1.5 血清样品采集及抗体水平检测

分别在免疫前及免疫后7、14、21、42、70、150、180、210、240 d，采集试验羊血液并分离血清，采用RBT、SAT分别检测试验羊的血清抗体水平。具体操作与判定按国家标准GB/T18646—2002进行。

1.6 资料分析

结果以“平均值±标准差”表示，利用SPSS 20. 0软件进行统计学分析，处理数据。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫前后试验羊血清抗体

在免疫前血清样品中均未检出抗体效价；免疫后的各试验羊均存在血清抗体效价；各试验组免疫前与免疫后的平均血清抗体效价差异极显著（P＜0.01）（图1）。皮下免疫组免疫后14、21、42、70 d之间的抗体效价差异不显著，但与其他时间点差异均显著；1.5倍剂量口服组21 d的效价与其他时间点差异显著，90 d与120 d的效价差异不显著，7 d与180 d的差异不显著；正常剂量口服组21 d的效价与其他时间点差异显著，14 d与90 d的差异不显著，7 d与120 d的差异不显著，150、180、210、240 d之间的效价差异不显著（表1）。

图1 皮下免疫组、正常剂量免疫组、1.5倍剂量免疫组抗体效价变化

2.2 试验组抗体阳性率情况

皮下免疫组免疫后7 d产生血清抗体，21 d抗体阳性率达100%（图2）；正常剂量口服组免疫后21 d产生抗体，抗体阳性率为50%（图3）；1.5倍剂量口服组免疫后14 d产生抗体，21 d抗体阳性率为82%（图4）。

图2 皮下免疫组阳性率曲线

表1 布病S2疫苗抗体效价统计结果

表1 布病S2疫苗抗体效价统计结果

注：同行数据肩标相同字母或无字母标注，表示差异不显著（P＞0.05）；肩标不同字母，表示差异显著（P＜0.05）

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图3 正常剂量口服组阳性率曲线

图4 1.5倍剂量口服组阳性率曲线

2.3 布病S2疫苗不同免疫途径抗体效价差异性

对各试验组的抗体效价结果分析发现，皮下免疫组在7 d抗体效价达1:347.5（-1.81±0.09）log2，显著高于正常剂量口服组与1.5倍剂量口服组（P＜0.01），240 d的皮下免疫组抗体效价仍显著高于正常剂量口服组与1.5倍剂量口服组，表明皮下免疫组的免疫效果最好，且持续时间显著优于1.5倍剂量口服组和正常剂量口服组；7～240 d内各时间点的1.5倍剂量口服组抗体效价显著高于正常剂量口服组（P＜0.05），表明1.5倍剂量口服组抗体存续时间显著优于正常剂量口服组。

3 分析与讨论

本试验采用皮下免疫和口服免疫2种途径进行免疫接种，通过长期连续跟踪检测，从抗体阳性率、抗体平均效价水平以及血清抗体存续时间等方面对S2疫苗免疫湖羊后的抗体消长规律进行探究。从图1、图2、图3中可以看到，皮下免疫组免疫后7 d即产生抗体，21 d抗体阳性率达到最高，抗体平均效价水平最高为1:400，抗体阳性率最高为100%，抗体存续时间为240 d；从表1可以看到，皮下免疫组的抗体平均效价水平高于1.5倍剂量口服组，1.5倍剂量口服组的又高于正常剂量口服组。白丽艳等[9]、刘宁[10]等检测发现正常剂量注射免疫S2疫苗后的RBT和SAT抗体阳性率最高为80%。樊生平等[11]肌注50亿菌的抗体阳性率最高为100%，抗体平均效价最高达1:2 358，与本研究结果相似。田素梅等[12]免疫S2疫苗后15 d平均抗体即达最高峰，抗体存续时间可持续280 d。高红霞等[13]研究发现，绵羊在免疫S2活菌苗后30 d，其体内血清抗体即达最高峰。蔡一非等[14]采取皮下免疫50亿活菌苗，7 d后体内血清抗体即达最高峰。上述研究结果表明，在S2疫苗免疫后7～30 d内，羊体内血清抗体可达峰值。

皮下免疫组血清抗体阳性率和抗体平均效价均远高于1.5倍剂量和正常剂量口服免疫组，抗体阳性率最高为100%，最高抗体效价为1:400（本试验检测最高值），且抗体存续时间可持续240 d。另外，据研究S2疫苗有一定的残余毒力[15-16]，其对怀孕母羊是否会引起流产等副作用尚不明确。本试验在皮下免疫后，出现1例死亡，有18例试验羊免疫后3～5 d内出现食欲下降、精神倦怠，个别羊免疫后1～2 d内，出现体温升高，之后自行恢复。因此，建议对未孕母羊采用皮下免疫，以保证免疫效果确实；对育成母羊配种前要进行全群检疫，对阴性母羊可采用皮下注射免疫，避免出现疫苗副反应，提高免疫安全性。

1.5 倍剂量口服组免疫后14 d即产生抗体，21 d达到高峰，RBT、SAT抗体阳性率最高分别 为80%、83%，抗体存续时间为150 d；正常剂量口服组免疫后21 d产生抗体并达到最高峰，RBT、SAT抗体阳性率最高分别为50%、57%，抗体存续时间为120 d。1.5倍剂量口服组抗体阳性率、平均抗体效价和抗体存续时间都优于正常剂量口服组。钟映梅等[17]对绵羊免疫S2疫苗，免疫后7 d检测到抗体，42 d血清抗体阳性率达峰值，口服免疫后抗体阳性率最高为41.1%。本试验结果也进一步验证了樊生平等[11]的研究观点：绵羊口服200亿和100亿免疫剂量抗体阳性率表现出明显差异。但与申捷等[18]的研究结果有所差异：绵羊口服100亿和200亿两种免疫将抗体阳性率差异较小。为进一步保证绵羊免疫效果，综合考虑抗体阳性率、抗体效价水平和抗体存续时间等因素，对怀孕母畜应选用1.5倍剂量口服免疫。

从检测方法和检测结果来看，RBT和SAT抗体阳性率曲线基本一致，但SAT检出的阳性数高于RBT。这与钟映梅等[17]、党富德等[19]的研究结果一致。原因可能与SAT以检测血清抗体IgM蛋白为主，而RBT则以IgG蛋白为主有关。因此，建议在大群检测时，首先使用RBT进行初检，对疑似阳性的用SAT复检，以保证检测结果准确可靠。

4 小结

本试验结果表明，S2疫苗皮下免疫和口服免疫方式的免疫效果差异较大。从血清抗体产生时间、抗体阳性率、抗体效价水平、抗体存续时间等方面来看，皮下免疫组均优于口服免疫组，但存在一定的副反应，1.5倍剂量口服免疫组优于正常剂量口服免疫组。因此，育成母羊配种前首先应进行全群检疫，对阴性母羊采用皮下注射免疫，对怀孕母畜宜用1.5倍剂量口服免疫。

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（责任编辑：朱迪国）

Study on the Antibody Dynamics of Vaccine Brucellosis Vaccine（S2）in Hu-sheep

Zhao Yongzhong，Fang Yupeng，Wang Jianjun，Dong Wei，Xu Kaiyun
（Wuwei Institute of Animal Husbandry and Veterinary，Wuwei，Gansu 733000）

S852.52

B

1005-944X（2017）10-0075-05

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.10.021

甘肃省种畜场布病检测净化计划