翟金晓，崔文，朱军

（济宁医学院法医学与医学检验学院，山东济宁272067）

咖啡因的中毒、检测及其应用研究进展

翟金晓，崔文，朱军

（济宁医学院法医学与医学检验学院，山东济宁272067）

咖啡因是茶叶、咖啡豆等天然植物中常见的一种黄嘌呤类生物碱化合物，是世界上使用最为广泛的精神活性药物。其在生活中普遍存在，与生命健康关系紧密，但咖啡因具有成瘾性，一旦停用会出现浑身困乏疲软、精神萎顿等各种戒断症状，因此被列入国家管制的精神药品范围。综述了近年来关于咖啡因及其代谢物的研究，总结了咖啡因的体内代谢、毒理作用、检测方法及其应用等方面内容，以期为法医毒物及临床工作者提供参考。

咖啡因；代谢产物；中毒；检测；LC-MS/MS；细胞色素P450酶1A2；肝功能

Abstract:Caffeine is a psychoactive stimulatory alkaloid that naturally exists in plants such as coffee beans，cocoa beans，tea leaves，and cola nuts.Caffeine is the world's most widely used psychoactive substance.It is widespread in people's life and is closely related to life and health.But caffeine is addictive，once stop using it，the objects may have withdrawal symptoms such as faint and weak and spirit withering.Therefore，it is included in the state control of psychotropic drugs. Cases of caffeine poisoning were reported occasionally.In addition，caffeine is the most classic and common probe drugs for studying the activity of CYP1A2 enzyme.Foreign countries have made caffeine as the iconic compound in the study of liver function.Thispaperreviewsthestudiesofcaffeineanditsmetabolites’chemicalcomposition，toxicology，pharmacokinetics，analyzing methods and application in recent years，providing reference for forensic toxicology and clinical peers.

Keywords:caffeine;metabolite;poisoning;analysis;LC-MS/MS;CYPlA2;liver function

咖啡因是茶叶、咖啡豆等天然植物中常见的一种黄嘌呤类生物碱化合物，主要分布于植物的幼嫩组织部位，化学式为C8H10N4O2，化学名为l，3，7-三甲基黄嘌呤（137X）[1]。咖啡因纯品为强烈苦味的白色粉状物，常用于治疗神经衰弱和昏迷复苏，是世界上使用最为广泛的精神活性药物，若长期或大剂量摄入咖啡因会对人体中枢神经系统造成损害，引发心脏病和高血压，且咖啡因具有成瘾性，一旦停用会出现浑身困乏疲软、精神萎顿等各种戒断症状，因此被列入国家管制的精神药品范围。此外，咖啡因也是国际奥委会禁用物质中受管制药物之一。目前，咖啡因类制剂的使用越来越广泛，常用的咖啡因制剂有感冒灵胶囊、复方氨酚烷胺片、氨基比林咖啡因片等。含咖啡因的饮料已经成为人们日常生活中补充能量和抵抗疲劳的主要产品，大多数功能性饮料中均含有咖啡因。成年人口服咖啡因后，吸收快而完全，生物利用度近100%，大量饮用很可能成瘾甚至中毒死亡。近些年，由于摄入过量咖啡因造成的急诊抢救、死亡案例日益增多。国内外有关咖啡因的中毒案件也有零星报道[2-3]。饮入过多能量饮料会导致失眠、精神紧张、头痛、焦虑、血压升高、心跳加快、癫痫发作，当与乙醇混用时后果更为严重[4]。咖啡因的中毒及检测一直备受人们关注，在食品安全研究以及法医鉴定中均具有重要的意义。本文就咖啡因的体内代谢、毒理作用、检测方法及其应用方面进行综述，以期为咖啡因中毒的法医学鉴定和临床诊治提供参考。

1 药理及毒理作用

1.1 药理作用

咖啡因具有较强的中枢兴奋作用，临床主要用作中枢兴奋药，在机体的多个系统中发挥着重要的作用[5]。其中对心血管具有正性作用，小剂量便能产生心率增快、血压升高等作用[6-7]，还能引起促肾上腺皮质激素和皮质醇合成的增加。在消化系统方面，可通过兴奋中枢神经系统的迷走中枢，刺激迷走神经胃支，从而引起胃泌酸增加和胃腺分泌亢进，也会刺激胃肥大细胞释放组胺，进而造成胃壁细胞泌酸增加[8]。在神经系统方面，咖啡因是中枢神经系统兴奋药，小剂量就能兴奋大脑皮质，改善思维活动，提高对外界的感应性。大剂量则会兴奋延髓的呼吸中枢和血管运动中枢，增加呼吸频率和深度。

1.2 毒理作用

咖啡因大剂量或长期使用会引起成瘾性，可致失眠、激动不安、心悸、头痛；剂量过大可引起惊厥，一旦停用会出现精神萎顿、浑身乏力等戒断症状。当其耐受性增强导致用药量不断增加时，咖啡因还会引起阵发性惊厥和骨骼震颤，损害肝、胃、肾等内脏器官，诱发呼吸道炎症等疾病。孕前和孕期使用咖啡因可致小鼠受孕延迟，胎鼠吸收胎、死胎、FGR发生率升高[9]。此外，咖啡因会给胎儿的新陈代谢系统增加负担，同时还可能减少胎盘血流量，对胎儿造成伤害。咖啡因的体内代谢半衰期较长，又具有成瘾性，体内容易产生蓄积，若连续饮用，则易引起蓄积中毒。咖啡因在体内代谢会产生茶碱，而茶碱类药物的治疗剂量与中毒剂量相当接近，其安全范围窄，极易引起中毒[4]。研究表明，咖啡因与老年人认知功能、蛋白质病变也有一定关联[10]。

2 咖啡因的体内代谢

咖啡因及其相关制剂口服后主要经胃肠道吸收，约15～60 min达到峰值浓度，此峰值可持续2 h，由于个体差异偶有胃排空延迟导致峰值会有所改变[11-16]。咖啡因首先是由小肠进入门脉循环，经首过消除效应，主要由细胞色素P450酶作用，随之进入全身大循环。由于咖啡因的首过消除效应较弱，所以经吸收后能完全地进入全身组织并且自由通过血、脑、胎盘、血-睾屏障。人体摄入的咖啡因几乎都是经肝脏代谢，一般咖啡因隔夜就会被肝脏代谢清除，其中只有不足5%的咖啡因以原形通过肾脏排泄。咖啡因在体内主要是3位脱甲基生成1，7-二甲基黄嘌呤（17X），17X再经C8-氧化生成1，7-二甲基尿酸（17U）。其次为7位脱甲基生成1，3-二甲基黄嘌呤（13X），最终生成1，3-二甲基尿酸（13U）。这两条途径使得咖啡因排在尿液中的代谢产物多达十几种[17]。口服咖啡因后，经3-N脱甲基化生成的17X（副黄嘌呤）为主要代谢产物，约占80%，这一步反应由药物代谢酶CYP1A2催化（部分由CYP2E1代谢）。此外，通过1-N脱甲基和7-N脱甲基分别生成的37X（可可碱12%）和13X（胆茶碱7%）分别由药物代谢酶CYP1A2和CYP2E1催化完成；进一步经3-N脱甲基化生成1X（1-甲基嘌呤）；17X和1X进一步经C8羟基化分别生成17U和1U，这两步反应分别由CYP2A6和黄嘌呤氧化酶催化完成[18]。37X为咖啡因的主要活性代谢产物，13X结构与咖啡因相近，但毒性作用却强于咖啡因，毒性作用时间也较长。咖啡因的代谢途径及其与代谢物的化学结构详见图1[19]。

图1 咖啡因的代谢途径及其与代谢物的化学结构

3 咖啡因及其代谢产物的检测方法

关于咖啡因及其代谢产物的检测，国内外一直有着相关的研究报道。一部分研究主要关注的是咖啡因和几个甲基嘌呤代谢产物的检测，而另一部分的研究则主要关注黄嘌呤和尿酸代谢产物的检测。目前咖啡因及其代谢物的主要检测方法主要有液相色谱法（HPLC）[16，18，20-22]、气相色谱-质谱联用法[23-24]、液相色谱-质谱联用法（LC-MS）[25-26]，液相色谱-质谱串联法（LC-MS/MS）[27-28]、核磁共振法（NMR）[29]等（表1）。在法医学领域中研究多集中在血液、尿液和组织等生物检材中咖啡因及其代谢物的检测[20，30-31]。LC-MS/MS检测器灵敏度高，离子筛选能力强，选择特异性高，可以极好地满足咖啡因及其代谢产物的同时检测及定量要求，因此越来越多的人采用此技术来进行相关的研究。对于生物检材中痕量咖啡因及其代谢物的同时检测方法是国内外研究中没有突破的一个问题，目前的检测方法没有全面满足体内检材的痕量、快速的分析，对于分析结果的评价和推断也仍存在缺陷。因此建立LCMS/MS对人体内的咖啡因及其主要代谢产物的定性定量方法实属必要。已有研究表明血液与唾液中咖啡因含量呈线性相关，相关系数为0.943（p<0.001）[32]，因此，也可考虑根据唾液咖啡因浓度的检测结果，进行血药浓度的推断，更有利于在实际工作中的现场检测和法医学鉴定。

表1 咖啡因及其代谢产物的检测方法

4 咖啡因检测相关应用

4.1 在肝功能评价中的应用

N-乙酰基转移酶（N-acetyltransferase，NAT2）、细胞色素P450酶1A2（Cytochrome P4501A2，CYPlA2）和黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XO）在药物代谢以及前致癌物激活的过程中均起着重要的作用，这些酶的活性与很多药物的疗效或毒性以及某些肿瘤的易感性密切相关，它们的不同活性状态的存在对于化学物质的体内转化必定产生一定的影响。因此，对上述药物代谢酶活性的测定有助于药物疗效的预测、药物毒副反应的预防以及临床个体化的合理用药[22]。其中，CYP450酶是药物在人体内氧化代谢过程中最主要的酶，其活性检测在肝功能评估中的作用受到越来越多的重视，CYP1A2酶是CYP家族主要成员之一，约占肝脏总CYP酶的13%，并且CYP1A2酶只在肝脏内表达。CYP1A2酶活性与肝脏代谢功能紧密相关，其活性的大小在一定程度上可直接反映肝脏的储备功能。目前评估CYP1A2酶的活性主要依靠药物探针法，因此选择一种合适、有效的探针药物至关重要。常用的探针药物主要包括非那西丁、咖啡因、茶碱等，其中咖啡因的体内摄入几乎均由肝脏代谢，约90%的咖啡因是由CYPlA2酶转化代谢的[33]，且咖啡因还能够增加其活性，因此常常通过检测咖啡因的代谢产物或计算咖啡因的代谢率来判断CYP1A2酶活性水平。另外，由于咖啡因是人类生活中广泛接触的外源物质且咖啡因的安全性高，也常被用作测定XO和NAT2活性的探针药物。应用咖啡因来分析NAT2是近年来发展起来的新方法，与其他探针药物相比咖啡因没有不良反应，受试者易于接受。因此，咖啡因是目前研究CYP1A2酶活性最经典、最常用的探针药物。现已有通过对人体内的咖啡因及其主要代谢产物的定性定量分析来判断CYPlA2等代谢酶活性评估的报道[16，21]，从而对其肝功能进行初步评价，为临床诊断及法医鉴定提供指导意义。用咖啡因代谢指数评估体内药物代谢酶活性一般采用尿液中的咖啡因代谢产物的比率（CMRs）来评估药物代谢酶活性，包括CYPlA2、CYP2A6、NAT2、XO[16]。也可测定咖啡因5种主要代谢产物，采取不同的代谢物比率及组合来反映NAT2、CYPlA2和XO这三种酶在体内的活性水平[22]。

4.2 在中毒案件中的应用

咖啡因成人口服致死量一般为10 g，中毒血浓度为15～60 μg/mL，致死血浓度为80 μg/mL[34]。相关案例多有报道，如，某女在出租房被发现昏迷，剧烈抽搐，多汗，呼吸急促，经医院抢救无效死亡，现场勘查发现死者手提包中有一氨基比林咖啡因片（100片）空药瓶。毒物检验心血中检出氨基比林、咖啡因和安乃近，含量分别为788.1、340.4、270.5 μg/mL[2]。另Banerjee P等[35]报道的咖啡因多例中毒死亡案例，一名57岁男性，心血中检测出咖啡因浓度为180μg/mL，一名39岁女性，检测出心血中咖啡因浓度为90μg/mL等。案例中死者心血中咖啡因含量均达到致死量，结合中毒症状及尸体解剖病理特征，可判断为咖啡因中毒死亡。功能性饮料滥用成瘾案例也偶有报道，如，某男12岁，因大量饮用可乐饮料，并反复出现戒断症状入院治疗。此人约两年前饮用可乐量开始增大，由开始的每天3瓶（600/mL/瓶），增至平均每天10瓶，最大量每天15瓶。期间伴有记忆力下降、反应迟钝、便秘等症状，停饮可乐后，出现头痛、腹痛、恶心呕吐、失眠、易激惹等症状，再次饮用可乐后，上述不适很快消失[3]，诊断为可乐依赖，中枢性尿崩症。临床中发现，绝大部分滥用止咳药水的青少年早期有将止咳药水和可乐合并滥用的现象，即所谓的“摇头水”滥用，更容易成瘾。统计市售含咖啡因饮品的咖啡因含量数据并加以标识，简便高效地监控长期饮用者体内咖啡因含量，及时给予介入治疗，可为合理饮用功能饮料提供准确的数据基础，为人类健康生活提供指示信息。

5 研究展望

综上所述，目前咖啡因的体内代谢过程及其主要代谢产物的研究已有一些报道，咖啡因及其代谢产物的检测技术和手段也在不断地提高和改进。建立快捷、准确、高灵敏度的多种饮品及生物检材中咖啡因定性定量分析方法，在食品安全研究以及法医鉴定中均具有重要的意义，为临床诊断及法医学鉴定实践中咖啡因中毒案件的取材及检测结果的评价提供指导信息。

此外，在临床应用及法医鉴定工作中，咖啡因作为经典的肝功能探针药物也在不断的被广泛研究，可通过咖啡因的代谢指数来评估CYPlA2、NAT2、CYP2A6和XO等药物代谢酶活性，从而对肝功能进行诊断评估，使得咖啡因及其代谢产物在科研中的应用也随着技术的发展而得到逐步的开发推广。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（二部）[M].北京：中国医药科技出版社，2015：649.

[2] 赵彬，曹文平.口服氨基比林咖啡因片中毒死亡1例[J].中国法医学杂志，2014，29（2）：174.

[3] 何日辉，王晓丽.可乐饮料成瘾一例[J].中国药物依赖性杂志，2008，17（6）：48.

[4] 沈敏，向平.滥用物质分析与应用[M].北京：科学出版社，2016：127-131.

[5] 李海霞，陈榕，周丹，等.咖啡因的合成及其药理作用的研究进展[J].华西药学杂志，2011，（2）：182-187.

[6] Smith PF，Smith A，Miners J，et al.The Safety Aspects of Dietary Caffeine[R].Australia:Report from the expert Working Group，2000：30-35.

[7] Hartley TR，Lovallo WR，Whitsett TL.Cardiovascular Effectsof Caffeine in Men and Women[J].Am J Cardiol，2004，93（8）:1022-1026.

[8] Kwiecien S，Konturek SJ.Gastric Analysis with Fraction Altest Meals（Ethanol，Caffeine，and Peptone Meal），Augmented Histamine or Pentagastrin Tests，and Gastric PH Recording[J].J Physiol Pharmacol，2003，54（S3）:69-82.

[9] 潘晓靓，刘冬琳，孟巍，等.咖啡因暴露对小鼠胚胎发育的影响[J].武汉大学学报（医学版），2008，29（2）：165-168.

[10] Ritchie K，Artero S，Portet F，et al.Caffeine，Cognitive Functioning and White Matter Lesions in the Elderly: Establishing Causality from Epidemiological Evidence[J]. Ritchie，2010，（1）：1-17.

[11] Chia HY，Yau WP，Ho HK.Establishing Population Distribution of Drug-Metabolizing Enzyme Activities for the Use of Salivary Caffeine as a Dynamic Liver Function Marker in a Singaporean Chinese Population[J].Biopharm Drug Dispos，2016，（37）：168-181.

[12] Marventano S，Salomone F.Coffee and Tea Consumption in Relation with Non-Alcoholic Fatty Liver and Metabolic Syndrome:A Systematic Review and Meta-analysis of Observational Studies[J].Clin Nutr，2016，35（6）:1269-1281.

[13] Tripathi A，Tiwari B，Patil R，et al.The Role of Salivary Caffeine Clearance in the Diagnosis of Chronic Liver Disease[J].J Oral Biol Craniofac Res，2015，（5）：28-33.

[14] Park GJ，Wiseman E，George J，et al.Non-Invasive Estimation of Liver Fibrosis in Non-Alcoholic Fatty Liver Disease Using the 13 C-caffeine Breath Test[J].J Gastroenterol Hepatol，2011，（26）:1411-1146.

[15] Rybak ME，Pao CI，Pfeiffer CM.Determination of Urine Caffeine and Its Metabolites by Use of High-performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry:Estimating Dietary Caffeine Exposure and Metabolic Phenotyping in Population Studies[J].Anal Bioanal Chem，2014，（406）:771-784.

[16] Begas E，Kouvaras E，Tsakalof AK，et al.Development and Validation of a Reversed-Phase HPLC Method for CYP1A2 Phenotyping by Use of a Caffeine Metabolite Ratio in Saliva[J].Biomed Chromatogr，2015，（29）：1657-1663.

[17]Denaro CP，Wilson M，Jacob P，et al.The Effect of Liver Disease on Urine Caffeine Metabolite Ratios[J].Clin Pharmacol Ther，1996，（59）:624-635.

[18] Caubet MS，Elbastw，Dubuc Mc，et al.Analysis of Urinary Caffeine Metabolites by HPLC-DAD the Use of Metabolic Rations to Assess CYP1A2 Enzyme Activity[J]. J Pharm Biomed Anal，2002，（27）:261-270.

[19] Caubet MS，Comte B，Brazier JL.Determination of Urinary C-13-Caffeine Metabolites by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry:the Use of Metabolic Ratios to Assess CYP1A2 Activity[J].J Pharm Biomed Anal，2004，（34）:379-389.

[20] Jordan NY，Mimper JY，Bogaard WJ，et al.Analysis of Caffeine and Paraxanthine in Human Saliva with Ultrahigh-Performance Liquid Chromatography for CYP1A2 Phenotyping[J].Journal of Chromatography B，2015，（995-996）:70-73.

[21] Perera V，Gross AS，McLachlan AJ.Caffeine and Paraxanthine HPLC Assay for CYP1A2 Phenotype Assessment Using Saliva and Plasma[J].Biomed Chromatogr，2010，（24）：1136-1144.

[22] 李军，彭向前，张鉴，等.HPLC直接进样测定咖啡因代谢物评价三种药物代谢酶活性[J].中国临床药理学与治疗学，2005，（10）：768-771.

[23] Regal KA，Howald WN，Peter RM，et al.Subnanomolar Quantification of Caffeine's in Vitro Metabolites by Stable Isotope Dilution Gas Chromatography-Mass Spectrometry[J].J Chromatogr B Biomed Sci Appl，1998，（708）: 75-85.

[24] 王玉飞.微量化学-GC/MS法测定茶叶中咖啡因的含量[J].中国卫生检验杂志，2005，（7）：818-819.

[25] 张婷，陈学国，杨瑞琴，等.液相色谱-质谱法测定指纹汗液中咖啡因及其代谢物[J].理化检验（化学分册），2015，（6）：795-799.

[26] Lawson G，Patel P，Mulla H，et al.Dried Blood Spot Sampling with LC-MS Analysis for Routine Therapeutic Caffeine Monitoring in Neonates[J].ISRN Chromatography，2012，（5）：1-7.

[27] Rybak ME，Pao CI，Pfeiffer CM.Determination of Urine Caffeine and Its Metabolites by Use of High-Performance LiquidChromatography-TandemMass Spectrometry:Estimating Dietary Caffeine Exposure and Metabolic Phenotyping in Population Studies[J].Anal Bioanal Chem，2014，（406）: 771-784.

[28] 李莉明，彭向东，阳国平，等.HPLC-MS/MS同时测定人血浆中对乙酰氨基酚和咖啡因含量的方法学研究[J].中南药学，2010，（6）：419-422.

[29] 卢爱民，蒋红梅，吕波，等.核磁共振氢谱内标法测定饮料中咖啡因含量[J].南京农业大学学报，2014，（6）：119-124.

[30] Jeff W，Terr D，Ashraf M.Analysis of Amphetamine，Methamphetamine，Methylenedioxyamphetamine and Methylenedioxymethamphetamine in Whole Blood Using in-Matrix Ethyl Ehloroformate Derivatization and Automated Headspace Solid-Phase Microextraction Followed by GC-MS[J].Forensic Toxicol，2008，（26）:66-70.

[31] Cone EJ.Oral Fluid Testing:New Technology Enables Drug Testing Without Embarrassment[J].J Calif Dent Assoc，2006，（34）:311-315.

[32] 贾娟，曹洁，王玉瑾，等.咖啡因在家兔唾液、尿液和血液中浓度的相关性研究[A].中国法医学会，公安部物证鉴定中心.中国法医学理论与实践创新成果精选[D].全国第九次法医学术交流会论文集，2013：201-203.

[33] Kot M，Daniel WA.The Relative Contribution of Human Cytochrome P450 Isoforms to the Four Caffeine Oxidation Pathways:an in Vitro Comparative Study with cDNAExpressed P450s including CYP2C Isoforms[J].Biochem Pharmacol.2008，（76）:543-551.

[34] 刘良.法医毒理学[M].北京：人民卫生出版社，2009：99.

[35] Banerjee P，Ali Z，Levine B，et al.Fatal Caffeine Intoxieation:aSeriesofEightCasesfrom1999to 2009[J].J Forensic Sci，2014，59（3）:865-868.

（本文编辑：施妍）

Recent Advances on the Study of the Poisoning，Analysis and Application of Caffeine

ZHAI Jin-Xiao，CUI Wen，ZHU Jun
（Institute of Forensic Medicine and Laboratory Medicine，Jining Medical University，Jining 272067，China）

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1671-2072.2017.05.005

1671-2072-（2017）05-0030-06

2017-05-18

济宁医学院青年教师科研扶持基金（JY2016KJ036Y）

翟金晓（1989—），女，助教，硕士，主要从事法医毒物分析研究。E-mail:zhaijinxiao@126.com。

崔文（1961—），男，教授，主要从事法医病理学与司法鉴定管理工作。E-mail:cuiwenmdd@163.com。