李利君，司天雷，马传国

(1.河南工业大学 小麦和玉米深加工国家工程实验室，郑州 450001; 2.河南工业大学 粮油食品学院，郑州 450001)

油脂安全

食用油中缩水甘油酯的检测方法研究进展

李利君1,2，司天雷1,2，马传国1,2

(1.河南工业大学 小麦和玉米深加工国家工程实验室，郑州 450001; 2.河南工业大学 粮油食品学院，郑州 450001)

缩水甘油酯(GEs)痕量存在于精炼食用油中。食用油中缩水甘油酯检测方法主要包括间接检测法和直接检测法。间接检测法即将缩水甘油酯通过酯交换反应，解离出缩水甘油，再通过衍生化后进行GC-MS测定。直接检测法在不破坏缩水甘油酯结构的基础上，先经过或不经过样品净化步骤直接测定。对食用油中缩水甘油酯检测方法的样品处理过程、仪器条件、结果进行综述，并对检测方法的优缺点进行分析。

食用油；缩水甘油酯；3-氯丙醇酯；间接检测法；直接检测法

Abstract：Glycidyl esters (GEs) are trace contaminants in refined edible oils.The quantitative methods for GEs in edible oils included both indirect determination methods and direct determination methods.Indirect determination methods were based on transesterification of GEs to produce free glycidol and it was determined by GC-MS after derivatization.Direct determination methods directly quantified GEs with or without clean-up steps.The sample preparation,instrument conditions,and results of indirect methods and direct methods of GEs in edible oils were described,and their advantages and disadvantages were also discussed.

Keywords：edible oil; glycidyl esters; 3-monochloropropanediol esters; indirect determination method; direct determination method

缩水甘油酯(GEs)是缩水甘油与脂肪酸的酯化产物，起初被推测为形成3-氯丙醇酯的一种物质，是由Kuhlmann[1]、Weiβhaar[2-3]等在研究3-氯丙醇酯的检测方法时发现。

Weiβhaar[3]、Bakhiya[4]等通过动物实验研究发现，缩水甘油酯是一种有遗传毒性的致癌物质。国际癌症研究机构(IARC)将缩水甘油酯定为人类2A级致癌物。美国毒理学规划处(NTP)认为缩水甘油酯是“很有可能对人类有致癌毒性的物质”。 Masukawa 等[5]对日本市售食用油样本进行了调研，发现所有测定的样本中都含有缩水甘油酯。德国联邦风险评估所指出以市售婴儿配方奶粉喂养的婴儿会摄入有危害程度的缩水甘油酯[6]。 因此，对食用油中缩水甘油酯含量测定的必要性越来越明显，建立一个准确并且灵敏的检测方法至关重要[7]。

缩水甘油酯在植物油中存在量比较少，具有一定的热不稳定性，因此对其检测有一定的难度。目前建立的缩水甘油酯的检测方法主要分为间接检测法和直接检测法。

1 间接检测法

间接检测法即将缩水甘油酯通过酯交换反应，解离出缩水甘油，再将缩水甘油进行衍生化后用GC-MS分析。主要有德国标准法DGF C-III 18(09)[8]、瑞士通用公证行法(SGS)[9-12]和酶催化法[13-16]。

1.1 德国标准法

处理方法 A(见图1)： 将样品溶于叔丁基甲醚，向样品中加入氘代3-氯丙醇 (3-MCPD)作为内标。再将样品与NaOCH3的甲醇溶液进行酯水解反应，使样品中的3-氯丙醇酯与缩水甘油酯转化为3-MCPD与缩水甘油解离出来，然后向反应体系中加入乙酸终止反应，再用正己烷将脂肪酸甲酯和不可皂化的物质除去。将得到的3-MCPD与苯硼酸反应，生成环状的苯硼酸酯，用NaCl溶液洗脱，在此步骤中，缩水甘油几乎能定量地转化为3-氯丙醇苯硼酸酯。 然后用正己烷将3-氯丙醇苯硼酸酯和内标物萃取出来，用GC-MS分析，得出样品中缩水甘油酯和3-氯丙醇酯的总含量。

处理方法B(见图2)：酯水解反应后，将得到的样品与硫酸的异丙醇溶液反应。这样缩水甘油酯的环氧被异丙醇开环，通过此步将体系中的缩水甘油除去。随后经过酯交换、苯硼酸衍生化、GC-MS分析等步骤得出样品中3-氯丙醇酯的含量，从而计算缩水甘油酯的含量。

图1 德国标准法处理方法A[8]

图2 德国标准法处理方法B[8]

1.2 瑞士通用公证行法(SGS)

处理方法A(见图3)：在样品中混入氘代棕榈酸3-氯丙醇二酯作为内标，将其溶于叔丁基甲醚，向其中加入NaOH或NaOCH3的甲醇溶液反应得到3-MCPD和缩水甘油。向反应体系中加入过量的酸化NaCl溶液，终止酯交换反应，期间缩水甘油与游离的氯离子反应得到3-MCPD和少量的 2-MCPD。用异己烷将水相萃取两次，除去一些非极性的物质。然后用乙醚，或乙酸乙酯，或两者的混合溶液多次萃取水相将分析物和内标萃入有机相。合并有机相，向其中加入苯硼酸，进行衍生化反应。浓缩，无水硫酸钠干燥，氮气吹干，复溶到异辛烷中，用GC-MS进行测定。

图3 瑞士通用公证行法处理方法A[9-12]

处理方法B(见图4)：酯水解得到3-MCPD和缩水甘油后，向反应体系中加入不含氯离子的酸化盐溶液(如硫酸钠，硫酸铵或者溴化钠)终止酯水解反应。后续的处理方法与处理方法A相同。由此测定样品中3-MCPD的含量，然后计算缩水甘油酯的含量。

图4 瑞士通用公证行法处理方法B[9-12]

1.3 酶催化法

为了缩短衍生化时间，Koyama[13-14]、Miyazaki[15-16]等发展了一种用Candidarugosa脂肪酶水解再溴化的方法，将水解时间缩短到30 min。该方法的衍生化步骤为将油样称入试管加入辛烷溶解，向试管中加入Candidarugosa脂肪酶的NaBr溶液，该溶液用磷酸氢二钠将pH调到6.8。室温摇床水解30 min，向反应体系中加入3-MCPD-d5和3-MBPD-d5内标混合液。反应液用正己烷洗两次，收集水相，与苯硼酸进行衍生化反应，之后用正己烷萃取，收集有机相，过滤，用GC-MS分析。此方法不仅可以检测食用油中缩水甘油酯的含量，还可以应用于蛋黄酱、人造黄油、奶粉等食品中缩水甘油酯含量的测定[15]。

德国MRI对德国标准法和SGS法的有效性进行了对比研究[17]。研究结果表明这两种衍生化方法均可靠，德国标准法测定值较高。SGS法通过同位素标记的内标物进行测定，灵敏度和准确度更好。

2 直接检测法

直接检测法是在不破坏缩水甘油酯结构的基础上，直接测定其含量的方法。由于油脂中含有较多的甘三酯和甘二酯，会影响缩水甘油酯的检测，大部分直接检测法都需要先净化样品，然后进行色谱分析。不过其中也有一些溶于有机溶剂后直接检测的方法。

Masukawa等[5]建立了一种双固相萃取(SPE)-三重四级杆LC-MS检测5种缩水甘油酯(棕榈酸缩水甘油酯、硬脂酸缩水甘油酯、油酸缩水甘油酯、亚油酸缩水甘油酯和亚麻酸缩水甘油酯)的方法。双固相萃取的步骤为：精确称取油样于离心管中，加入乙腈溶解后离心，取上清液，用C18固相萃取柱萃取，乙腈洗脱。收集洗脱液，氮气吹干，氯仿复溶；再用硅胶固相萃取柱萃取，用氯仿洗脱，收集洗脱液，氮气吹干，用甲醇-异丙醇(体积比1∶1)混合液复溶，再进行LC-MS测定。该方法采用外标法定量,定量限为0.045～0.12 μg/mL。当此方法应用于以甘三酯为主要成分的油样检测时，回收率为71.3%～94.6%(平均为79.4%)，相对偏差为 2.9%～12.1%。当此方法应用于甘二酯含量高的油样检测时，回收率为90.8%～105.1%(平均97.2%)，相对偏差为2.1%～12.0%。随后又对此方法进行了改进[18],用传统的HPLC代替三重四级杆液质联用，用氯仿-丙酮混合液代替乙腈溶解油样，扩展了该方法的应用范围。Shiro[19]、刘京[20]等对这一方法进行改进，将检测时间从15 min缩短为5 min。考虑到氯仿的毒性，用叔丁基甲醚-乙酸乙酯代替氯仿-丙酮溶解油样，在第二次固相萃取时，用正己烷-乙酸乙酯代替氯仿洗脱。改进后方法的定量限可达到0.082～0.11 μg/g。

Dubois等[21]建立了一种凝胶色谱萃取(GPC)-固相萃取(SPE)-LC-TOF-MS或LC-MS/MS检测油样中7种缩水甘油酯(棕榈酸缩水甘油酯、硬脂酸缩水甘油酯、油酸缩水甘油酯、亚油酸缩水甘油酯、亚麻酸缩水甘油酯、月桂酸缩水甘油酯和豆蔻酸缩水甘油酯)含量的方法。具体步骤为：将加入混标的油样溶于正己烷-乙酸乙酯(体积比1∶1)的混合溶液中,用凝胶色谱萃取，洗脱液为正己烷-乙酸乙酯(体积比1∶1)，收集洗脱液，浓缩、氮吹、复溶于丙酮直接用LC-MS测定。根据不同样品成分的不同，有一些样品需要复溶于二氯甲烷固相萃取后再进行LC-MS测定。样品的测定同时在LC-TOF-MS和LC-MS/MS上进行。LC-MS/MS相对于LC-TOF-MS优势不大，原因在于LC-MS/MS测定时会由于碰撞分解产生非选择性的离子。用GPC-SPE-LC-MS/MS测定油样时，该方法的定量限为0.05～0.1 μg/g，回收率为68%～111%。

Granvogl等[22]报道了稳定同位素分析硅胶萃取-LC-MS测定样品中缩水甘油酯含量的方法。采用硅胶萃取的方法清洗样品，再用HPLC-APCI-MS测定。该方法的回收率比较低，最低的回收率约为34%。Macmahon等[23]用类似的方法，用硅胶固相萃取柱代替硅胶清洗样品，用HPLC-APCI-MS/MS测定，方法的回收率为79%～114%，相对标准偏差为3%～16%。

Becalski[24]、Aniolowska[25]等也用稳定同位素标记作为内标，建立了一种双固相萃取(SPE)-LC-MS/MS测定食品中缩水甘油酯含量的方法。具体步骤为将样品溶于丙酮，加入氘代缩水甘油酯作为内标物，依次用C18和正相硅胶固相萃取柱萃取，洗脱液依次为甲醇和5%乙酸乙酯的正己烷溶液。如果样品中分析物的含量较低，低于0.5 mg/kg,需要对样品预浓缩，再进行固相萃取。萃取液溶于甲醇-异丙醇(体积比1∶1)溶液中,用LC-MS/MS测定。用初榨橄榄油测定该方法的回收率为84%～108%。待测油样质量为10 mg 时，该方法的检出限为0.07～0.15 μg/g；待测油样质量为0.5 g 时，该方法的检出限为0.001～0.003 μg/g。而且该方法还可以用于牛奶和饼干等食品中缩水甘油酯含量的检测。

由于缩水甘油酯的热不稳定性，在其测定方法中，限制了GC-MS的使用。Steenbergen等[26]通过调节进样方式，严格控制GC条件避免缩水甘油酯的分解，建立了正相液相色谱(NPLC)萃取-GC-MS测定缩水甘油酯的方法。该方法的检出限接近于0.01 μg/g,回收率为85%～115%。

Haines等[27]建立了一种用LC-TOF-MS直接检测油样中缩水甘油酯含量的方法。具体步骤为：将油样溶于含有氘代3-氯丙醇二油酸酯和氘代缩水甘油棕榈酸酯内标的流动相溶液中，直接进样用LC-TOF-MS测定。其中流动相A为0.26 mol/L醋酸钠的甲醇溶液-甲醇-乙腈(体积比1∶8∶1)，流动相B为0.26 mol/L醋酸钠的甲醇溶液-二氯甲烷-乙腈(体积比1∶8∶1)。该方法应用于检测棕榈油中缩水甘油酯的含量时，检出限为0.07～0.29 μg/g，相对标准偏差为5%～10%。该方法为了使待测物更好地电离，流动相中加入的钠盐会污染MS系统。而且流动相还会造成离子源部分(比如ESI喷雾器针)的腐蚀。Blumhorst等[28]对此方法进行了改进。将样品溶于丙酮，直接用LC-MS代替LC-TOF-MS测定，其中流动相A变为甲醇-乙腈-水(体积比17∶17∶6)，流动相B为丙酮，这样避免了污染质谱系统的不足。改进后方法的检出限为 0.04～0.16 μg/g。

3 结束语

缩水甘油酯的检测方法主要包括间接检测法和直接检测法。间接检测法通过衍生化步骤，将所有种类的缩水甘油酯都转化为一种物质，测定的灵敏度高，而且测定过程中所需要的标准品少，费用较低。但是在衍生化过程中可能因为衍生化反应不完全，氯丙醇酯与缩水甘油酯之间转化等因素，造成测量偏差，而且间接检测法也无法测定缩水甘油酯的具体类型。直接检测法可以避免间接检测法中衍生化反应不完全的缺点，而且可以测定缩水甘油酯的种类，便于后续的研究，但是所需标准品比较多，费用较高。大部分直接检测法为了减少对仪器的污染，以及提高检测的准确性，在进行仪器检测前，都需要烦琐的净化步骤，有些方法对仪器的要求也比较高，应用的普适性不好。

研究人员虽然建立了很多不同的检测方法，但是对这些方法的综合评价、对比研究以及交叉实验室认证还比较少，尚未形成一种统一的、普遍接受的方法，而且大部分检测方法都比较费时、费力。因此，建立一种便捷、准确、灵敏、经济的检测食用油中缩水甘油酯的方法成为迫切需要。

[1] KUHLMANN J.Überbefunde bei der bestimmung von 3-MCPD-ester in ölen & fetten? mõgliche ursachen und konsequenzen [R].Berlin: Federal Institute for Risk Assessment(BfR),2008.

[2] WEIβHAAR R.Determination of total 3-chloropropane-1,2-diol (3-MCPD) in edible oils by cleavage of MCPD esters with sodium methoxide[J].Eur J Lipid Sci Technol,2008,110:183-186.

[3] WEIβHAAR R,PERZ R.Fatty acid esters of glycidol in refined fats and oils[J].Eur J Lipid Sci Technol,2010,112:158-165.

[4] BAKHIYA N,ABRAHAM K,GÜRLER R,et al.Toxicogogical assessment of 3-chloropropane-1,2-diol and glycidol fatty acid esters in food[J].Mol Nutr Food Res,2009,55(4):509-521.

[5] MASUKAWA Y,SHIRO H,NAKAMURA S,et al.A new analytical method for the quantification of glycidol fatty acid esters in edible oils[J].J Oleo Sci,2010,59: 81-88.

[6] Federal Institute for Risk Assessment (BfR).Initial evaluation of the assessment of levels of glycidol fatty acid esters detected in refined vegetable fats (in German)[R].Berlin: Federal Institute for Risk Assessment(BfR),2009.

[7] CREWS C,CHIODINI A,GRANVOGL M,et al.Analitical approaches for MCPD esters and glycidyl esters in food and biological samples: a review and future perspectives[J].Food Addit Contam Part A,2013,30(1): 11-45.

[8] German Standard Methods for the Analysis of Fats and other Lipids: C-III 18 (09).Ester-bound 3-chloropropane-1,2-diol (3-MCPD-Esters) and glycidol(glycidyl esters)-determination in fats and oils by GC-MS[S].WVG: Stuttgart,2009.

[9] KUHLMANN J.Determination of bound 2,3-epoxy-1-propanol(glycidol) and bound monochloropropanediol (MCPD) in refined oils[J].Eur J Lipid Sci Technol,2011,113: 335-344.

[10] 石贞，李昌模，柴佳，等.食用油脂中缩水甘油酯检测方法的研究[J].中国食物与营养，2011,17(11): 5-9.

[11] 王力清，陈洪涛，黄翠莉，等.食用油脂中3-MCPD脂肪酸酯和缩水甘油脂肪酸酯分析方法研究进展[J].粮食与油脂，2014,27(4): 6-9.

[12] 刘国琴，尹诗琴，汪学德.气相色谱-质谱联用法测定食用油脂中的缩水甘油酯[J].现代食品科技，2016,32(5): 289-294.

[13] KOYAMA K,MIYAZAKI K,ABE K,et al.Optimization of an indirect enzymatic method for the simultaneous analysis of 3-MCPD,2-MCPD,and glycidyl esters in edible oils[J].J Oleo Sci,2015,64(10): 1057-1064.

[14] KOYAMA K,MIYAZAKI K,ABE K,et al.Collabororative study of an indirect enzymatic mehtod for the simultaneous analysis of 3-MCPD,2-MCPD,and glycidyl esters in edible oils[J].J Oleo Sci,2016,65(7): 557-568.

[15] MIYAZAKI K,KOYAMA K,SASAKO H,et al.Indirect method for simultaneous determinations of 3-chloro-1,2-propanediol fatty acid esters and glycidyl fatty acid esters[J].J Am Oil Chem Soc,2012,89:1403-1407.

[16] MIYAZAKI K,KOYAMA K.Application of indirect enzymatic method for determinations of 2-/3-MCPD-Es and Gly-Es in foods containing fats and oils[J].J Am Oil Chem Soc,2016,93: 885-893.

[17] FIEBIG H J.Determination of ester-bound 3-chloro-1,2-propanediol and glycidol in fats and oils a collaborative study[J].Eur J Lipid Sci Technol,2011,113: 393-399.

[18] MASUKAWA Y,SHIRO H,KONDO N,et al.Generallized method to quantify glycidol fatty acid esters in edible oils[J].J Am Oil Chem Soc,2011,88:15-21.

[19] SHIRO H,KONDO N,KIBUNE N,et al.Direct method for quantification of glycidol fatty acid esters in edible oils[J].Eur J Lipid Sci Technol,2011,113:356-360.

[20] 刘京，张晖，王瑛瑶，等.液相色谱-质谱法测定食用植物油中缩水甘油酯的含量[J].食品工业科技，2014,35(15):308-311.

[21] DUBOIS M,TARRES A,GOLDMANN T,et al.Determination of seven glycidyl esters in edible oils by gel permeation chromatography extraction and liquid chromatography coupled to mass spectrometry detection[J].J Agric Food Chem,2011,59:12291-12301.

[22] GRANVOGL M,SCHIEBERLE P.Quanitation of glycidyl esters via stable isotope dilution analysis[R].Cincinnati: 102nd AOCS Annual Meeting & Expo,2011.

[23] MACMAHON S,BEGLEY T,DIACHENKO G.LC-MS/MS detection of glycidly esters and 3-MCPD esters in edible oils[R].Cincinnati: 102nd AOCS Meeting & Expo,2011.

[24] BECALSKI A,FENGS Y,LAU B P Y,et al.Glycidyl fatty acid esters in food by LC-MS/MS: method development[J].Anal Bioanal Chem,2012,403: 2933-2942.

[25] ANIOLOWSKA M,KITA A.Monitoring of glycidyl fatty acid esters in refined vegetable oils from retail outlets by LC-MS[J].J Sci Food Agric,2016,96: 4056-4061.

[27] HAINES T D,ADLAF K J,PIERCEALL R M,et al.Direct determination of MCPD fatty acid esters and glycidyl fatty acid esters in vegetable oils by LC-TOFMS[J].J Am Oil Chem Soc,2011,88: 1-14.

[28] BLUMHORST M R,VENKITASUBRAMANIAN P,COLLISON M W.Direct determination of glycidyl esters of fatty acids in vegetable oils by LC-MS[J].J Am Oil Chem Soc,2011,88: 1275-1283.

Progressinanalyticalapproachesforglycidylestersinedibleoils

LI Lijun1,2,SI Tianlei1,2,MA Chuanguo1,2

(1.National Engineering Laboratory for Wheat & Corn Further Processing,Henan University of Technology,Zhengzhou 450001，China; 2.College of Food Science and Technology，Henan University of Technology，Zhengzhou 450001，China)

TS225;TS207.3

A

1003-7969(2017)09-0083-05

2017-01-09；

2017-07-12

“十三五”国家重点研发计划子课题(2016YFD0401404)

李利君(1986)，女，讲师，博士，研究方向为油脂化学(E-mail)lilijun@iccas.ac.cn。

马传国，教授，博士生导师(E-mail)mcg66@163.com。