谷锋，杨继宏，李琮，张洪安，康明，段文都，刘岩

(1河北大学附属医院，河北保定071000；2华北油田总医院)

肝细胞癌组织中维甲酸相关孤核受体α的表达变化及其意义

谷锋1，杨继宏2，李琮1，张洪安1，康明1，段文都1，刘岩1

(1河北大学附属医院，河北保定071000；2华北油田总医院)

目的观察肝细胞癌(HCC)组织中维甲酸相关孤核受体α(RORα)的表达变化，并探讨其临床意义。方法取92例HCC患者，术中获取HCC组织和癌旁正常肝组织各92例份。分别采用免疫组化法及Western blotting法检测HCC组织和癌旁正常肝组织中的RORα、VEGF，分析RORα表达与HCC临床病理参数的关系。结果HCC组织及正常肝组织中RORα阳性分别为31(33.7%)、62(67.3%)例，VEGF阳性分别为74(80.4%)、17(18.5%)例。HCC组织中RORα阳性表达率低于正常肝组织，VEGF阳性表达率高于正常肝组织(P均<0.05)。HCC组织及正常肝组织中RORα相对表达量分别为0.52±0.07、1.70±0.03，VEGF相对表达量分别为1.94±0.08、0.55±0.07。HCC组织中RORα相对表达量低于正常肝组织，VEGF相对表达量高于正常肝组织(P均<0.05)。HCC组织中RORα与VEGF表达无相关性(P>0.05)。RORα阳性表达与HCC患者的年龄、性别、肿瘤直径、临床分期、淋巴结转移情况等无关(P均>0.05)。HCC病理分级为Ⅰ～Ⅱ级者RORα阳性表达比例高于Ⅲ级者(P<0.05)。结论HCC组织中RORα表达下调，且与HCC的病理分级有关。RORα表达异常可能参与了HCC的发生发展。

肝肿瘤；肝细胞癌；维甲酸相关孤核受体α；血管内皮生长因子

原发性肝癌(PLC)是人类最常见的肿瘤之一，病死率高，其中有90%以上为原发性肝细胞性肝癌(HCC)。肝癌的发病较为隐匿，仅有接近30%的患者可在患病初期诊断并得到手术治疗机会，多数中晚期患者只能采用非手术治疗方式。研究肝癌细胞的分化、增殖、复发及转移的分子机制，对HCC的诊断、病程进展及预后评估有重要意义。维甲酸类孤儿核受体(ROR)是孤核因子家族的一个亚科，因其序列与维甲酸受体(RAR)和维甲酸X受体(RXR)相似，由此得名。RORα是第一个被发现的ROR家族成员。RORα在多种组织和细胞中均有表达，包括大脑、肌肉、肠、心脏、皮肤、肺、肝、脾、白细胞和乳腺上皮细胞等[1]。RORα的异常活化与多种疾病相关，例如骨质疏松症、自身免疫性疾病、哮喘等[2,3]。RORα在多种人类肿瘤中表达下调，发挥肿瘤抑制因子的作用。但对于RORα与HCC的关系目前研究较少，且无明确研究成果。本研究观察了HCC组织中RORα的表达变化，并探讨其临床意义。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 住院手术治疗的HCC患者92例，其中男51例、女41例，年龄24～93岁。病理分级Ⅰ～Ⅱ级患者36例，Ⅲ级患者56例；淋巴结转移阳性患者40例。术中分别切取非坏死区HCC组织及距肿瘤边缘至少1 cm的癌旁组织，各92例份。

1.2 RORα、VEGF检测 ①免疫组化法：对组织切片进行免疫组化染色。步骤如下：60 ℃烘烤切片2 h，4 μm厚度石蜡切片脱蜡至水；双氧水阻断内源性过氧化物酶，在0.01 mol/L的枸橼酸缓冲液中90 ℃微波抗原修复8 min；5%二抗正常血清室温孵育封闭1 h；RORα(1∶100)或VEGF(1∶150)一抗稀释后室温孵育1 h；聚合物增强剂室温孵育20 min，酶标抗鼠聚合物室温孵育20 min，常规DAB显色。以磷酸缓冲液PBS代替一抗作为阴性对照，同时做空白对照。每张切片选取5个视野，以细胞核或细胞质染成棕黄或棕褐色且大于5%的细胞着色判断为蛋白表达阳性。②Western blotting法：取新鲜冰冻HCC组织和癌旁正常肝组织按照重量体积比1∶3加入组织裂解液(10 mmol/L的Tris-Cl，pH 8.0，150 mmol/L的NaCl，1 mmol/L的EDTA，1% NP-40，10%甘油及蛋白酶抑制剂)进行裂解，BCA法测定总蛋白浓度。配置10%分离胶和8%浓缩胶，取50 μg组织总蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(32 mA，60 min)；110 V条件下转膜120 min；5%脱脂奶粉封闭1 h后，加抗RORα(1∶1 000)及抗VEGF(1∶1 000)抗体室温孵育1 h；TBST漂洗，二抗(1∶5 000)室温孵育1 h；TBST漂洗，电化学发光法检测。扫描蛋白条带灰度值，用Image J软件软件进行分析。以目的蛋白条带灰度值与内参GAPDH条带灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达量。

1.3 统计学方法 采用SPSS17.0软件进行统计学分析。计量资料采用t检验。计数资料采用χ2检验。RORα与VEGF的相关性分析采用Pearson相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HCC组织及正常肝组织中RORα、VEGF表达比较 免疫组化染色示RORα主要定位于肝细胞核，呈棕色颗粒状或灶性分布；正常肝组织大部分能被染色，HCC组织只有少部分被染色，且正常肝细胞均着色较深，呈深棕色；VEGF表达于细胞质中，正常肝组织中细胞染色为阴性或浅棕色，HCC组织均能被染色，且部分病例着色颜色较深，呈深棕色。详见图1。HCC组织及正常肝组织中RORα阳性分别为31(33.7%)、62(67.3%)例，VEGF阳性分别为74(80.4%)、17(18.5%)例。HCC组织中RORα阳性表达率低于正常肝组织，VEGF阳性表达率高于正常肝组织(P均<0.05)。HCC组织及正常肝组织中RORα相对表达量分别为0.52±0.07、1.70±0.03，VEGF相对表达量分别为1.94±0.08、0.55±0.07。HCC组织中RORα相对表达量低于正常肝组织，VEGF相对表达量高于正常肝组织(P均<0.05)。见图2。进一步分析结果显示HCC组织中RORα与VEGF表达无显著相关性(P>0.05)。

注：T为HCC组织；N为癌旁正常肝组织。

图1HCC组织和癌旁正常肝组织中RORα、VEGF表达情况(免疫组化法)

图2 HCC组织与正常肝组织中RORα、VEGF表达情况(Western blotting法)

2.2 RORα表达与HCC临床病理参数的关系 RORα阳性表达与HCC患者的年龄、性别、肿瘤直径、临床分期、淋巴结转移情况无关(P均>0.05)。HCC病理分级为Ⅰ～Ⅱ级者RORα阳性表达比例高于Ⅲ级者(P<0.05)。详见表1。

表1 RORα阳性表达与HCC临床病理参数的关系

注：与Ⅰ～Ⅱ级者相比，*P<0.05。

3 讨论

RORα是家族成员之一，参与多种重要生理功能的调节，在细胞分化、生物体发育、神经调控等方面发挥重要作用[4]。RORα从N端到C端包含多个结构域，可执行多种功能，其中的锌指模序1和锌指模序2可与特殊DNA序列ROR反应元件(RORE)进行特异性结合，从而调节靶基因转录[5]。经鉴定发现，生物体中多种肿瘤相关基因也含有RORE，如N-myc、Nm23。因此，ROR在肿瘤的发生发展中同样发挥重要作用[6,7]。

基因微阵列研究数据表明，多种肿瘤组织中RORα mRNA表达水平显著下调[8,9]。其中胃癌细胞中RORα基因存在甲基化沉默现象，提示甲基化可能导致RORα表达下调[10]。RORα在结肠癌、乳腺癌和前列腺癌组织中表达也下调。研究[11]显示，RORα过量表达可抑制Wnt/β-Catenin信号通路功能，后者在多种肿瘤中均存在异常激活，提示RORα可能通过调控Wnt/β-Catenin信号通路功能进而影响肿瘤的发生发展。目前有关RORα在肝癌发展中的作用研究较少[12]。最近报道显示，肝癌患者外周血中检测到RORα异常表达，RORα可能参与肝癌的肿瘤血管生成。因此，本研究不仅观察了HCC组织中RORα的表达变化，同时检测了与肿瘤血管生成密切相关的VEGF，期望探讨RORα在肿瘤血管生成中的作用。

本研究结果显示，RORα在HCC组织中的阳性表达率及表达水平较癌旁正常肝组织明显下降，且随着HCC病理分级增加，RORα表达下调越明显，提示RORα在HCC发生发展过程中发挥抑制肿瘤生长的作用。本研究结果还显示，VEGF在HCC组织中表达显著上调，但RORα和VEGF在HCC组织中的表达无相关性，提示RORα可能并不参与对VEGF的直接调控。最新研究结果显示，在NP细胞中抑制RORα表达可调节HIF1α-TAD的活性，但与HIF1α的靶基因VEGF、PFKFB3、Eno1的表达变化无直接关系[13]。还有研究者发现，RORα可促使p53蛋白稳定表达；利用最新合成的一种ROR激动剂作用于肿瘤细胞后，可使得p53稳定表达并诱导肿瘤细胞凋亡[14]。ROR激动剂有望应用于相关肿瘤的临床治疗[15]。

Wnt/β-Catenin信号通路是维持肝脏正常生理功能的关键通路，也与多种肝病的发病有关。最新研究显示，在肝癌中，Wnt/β-Catenin和Notch信号通路可提高肝癌干细胞的干细胞活性，并且Notch1作为Wnt/β-Catenin的下游蛋白对该通路有反馈调节作用。我们推测RORα可通过Wnt/β-Catenin通路调控肝癌进展。Cyclin D1、MMP7、c-MYC和E-cadherin等肿瘤相关蛋白均为Wnt/β-Catenin通路的下游靶蛋白，在肝癌细胞的增殖、侵袭和凋亡等过程中发挥重要作用。还有有学者发现，RORα可显著抑制胃癌MGC803细胞中E-cadherin表达和EMT过程。因此，在肝癌中，RORα是否参与Wnt/β-Catenin信号通路、EMT和肿瘤血管生成过程调节是进一步研究的焦点。

综上所述，HCC组织中RORα表达下调，且与肿瘤病例分级有关。对RORα深入研究有助于进一步阐述HCC的形成和演变机制，有望为HCC的临床诊断及治疗相关研究提供新的方向。同时，HCC组织中RORα与VEGF表达无相关性，提示RORα在HCC发生发展过程中并不参与肿瘤血管生成的直接调控，也为下一步研究提供了参考。

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2017-03-06)

刘岩(E-mail: sanbenyange@sina.com)