李 斌，吕 政

（1.福建省公安厅刑事技术总队，福建 福州350003；2.福州市鼓楼区公安局，福建 福州350003）

利用AutoMate ExpressTM系统提取陈旧性骨骼DNA

李 斌1，吕 政2

（1.福建省公安厅刑事技术总队，福建 福州350003；2.福州市鼓楼区公安局，福建 福州350003）

目的 建立利用AutoMate ExpressTM系统提取陈旧性骨骼DNA的方法。 方法 将骨骼用冷冻研磨机研磨成骨粉，经AutoMate ExpressTM系统提取后，用Identifiler®Plus、MiniFilerTM试剂盒扩增分型。 结果10例保存在不同环境中、死亡时间在10～20年的骨骼样本利用AutoMate ExpressTM系统3 h内完成DNA提取，有8例获得完整STR分型。 结论AutoMate ExpressTM系统能快速、高效地提取陈旧性骨骼DNA，可应用于法医实际案件检验。

法医遗传学；骨骼；DNA；AutoMate ExpressTM系统

近年来，骨骼DNA检验技术已取得很大进展，在实际案件的侦破中发挥重要作用。但是，对于陈旧性骨骼，由于细胞含量少，以及长时间受埋葬环境的影响，其DNA的提取仍然是鉴定工作的难点[1]。本研究利用AutoMate ExpressTM系统自动快速提取陈旧性骨骼DNA，并结合运用MiniFilerTM试剂盒，获取理想的STR分型结果。

1 材料与方法

1.1 样本材料

本研究选取的骨骼来自美国北德州大学法医遗传中心实验室日常检案中收集的10例白骨化骨头（随机编为1～10号样本），其中股骨、肱骨各5例；保存环境有土壤、埋葬的棺杶和暴露在公路、山林等；尸体估计死亡时间在10～20年。

1.2 仪器与试剂

PrepFiler Express BTATM试剂盒、QuantifilerTM法医人类DNA定量试剂盒、Identifiler®Plus试剂盒、MiniFilerTM试剂盒，AutoMate ExpressTM系统、7500型荧光定量PCR仪、3130xl型基因分析仪。以上仪器和试剂全部来自美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 骨骼前处理

用手术刀片刮除并洗净骨骼表面的垢物，置于紫外光下照射30 min。将骨骼的骨干锯成小骨片，取小骨片置烧杯中用5%次氯酸钠溶液浸泡15 min后弃去液体，用水洗净次氯酸钠直至没有氯气味，再用无水乙醇浸泡5 min弃去液体，小骨片置于通风橱中自然风干。而后，将小骨片用冷冻研磨机磨成骨粉备用。

1.3.2 DNA提取

称取骨粉0.2 g置于2 mL的管中，加入375μL PrepFiler BTATMLysis缓冲液、5μL 1 mol/L DTT、10μL PK。56℃温浴振荡消化2.5 h，离心半径8.6 cm，13 300 r/min，离心2 min，转移上清液至样品管中，与PrepFiler Express BTATM试剂盒一起放入AutoMate ExpressTM系统中，选择Prepfiler BTA程序提取DNA。每次实验有空白对照。具体操作步骤按照使用说明书进行。

1.3.3 DNA定量

采用QuantifilerTM法医人类DNA定量试剂盒在7500型荧光定量PCR仪上进行DNA定量，实验重复3次，取平均值。

1.3.4 STR扩增及其电泳分型

用Identifiler®Plus和MiniFilerTM试剂盒进行复合扩增，扩增体系为25μL，模板量为10μL，Identifiler® Plus试剂盒扩增循环数为29个循环、MiniFilerTM试剂盒扩增循环数为30个循环。扩增产物在3130xl型基因分析仪上进行毛细管电泳，用GeneMapper®ID v3.2软件分析。

2 结 果

10例保存在不同环境中、死亡时间在10～20年的骨骼样本，经过AutoMate ExpressTM系统处理，提取到的DNA质量浓度在0.012～0.218 ng/μL，用Identifiler® Plus试剂盒扩增，有3例获得完整STR分型；结合MiniFilerTM试剂盒，获得完整STR分型样本数提高到8例（表1）。其中，10～12年的骨骼样本经AutoMate ExpressTM系统处理，提取的DNA质量浓度较高，在0.108～0.218 ng/μL，可获得较好的STR分型。如1号样本土中埋葬约10年的股骨，用AutoMate ExpressTM系统提取DNA后，经Identifiler®Plus试剂盒扩增，获得完整STR分型，谱带相对荧光单位（RFU）最高峰值为1 631 RFU（图1）。

表1 不同骨骼样本情况和DNA分型结果

图1 土中埋葬约10年的股骨Identifiler®Plus分型

用AutoMate ExpressTM系统处理13年以上的骨骼样本，提取的DNA质量浓度在0.012～0.084 ng/μL，用Identifiler®Plus试剂盒扩增，峰高不平衡，出现不同程度的等位基因丢失现象，较难获得理想的STR分型。结合MiniFilerTM试剂盒扩增，大部分可获得完整的STR分型。如样本10暴露在山上树林死亡时间约20年的股骨，提取DNA经Identifiler®Plus试剂盒扩增，获得不完全DNA分型，大片段基因座如CSF1PO、D2S1338、D18S51有等位基因丢失现象，谱带最高峰值为644RFU。结合MiniFilerTM试剂盒扩增，所有基因座均得到DNA分型，谱带最高峰值为1 471 RFU（图2）。

图2 样本10的基因分型

3 讨 论

提取陈旧性骨骼DNA所面临的难点在于如何有效去除PCR抑制物，减少外部污染，获得大量和高质量的DNA模板。AutoMate ExpressTM系统在解决上述问题上有以下优点：（1）提取时间短。使用AutoMate ExpressTM系统，骨粉消化时间只需2～2.5 h（笔者通过预实验，发现延长消化时间直至过夜，并没有提高DNA提取效果），系统中运行0.5 h，总共需3 h就能完成提取过程，与高林林等[2]研究结果相同，并且可同时做13个样本，快速、高效。而传统方法[3-5]需24 h消化、脱钙后才能开始提取步骤。（2）防止污染。骨骼是低拷贝样本，AutoMate ExpressTM系统操作简便，采用磁性树脂的吸附能力，将DNA特异性地结合在磁性树脂上，以达到纯化目的，减少污染的可能性。其他方法如使用QIAquickTM二氧化硅柱吸附纯化DNA[6]，操作步骤多，加剧DNA流失，影响DNA回收率，增加了污染的机会。（3）有利操作人员的健康。AutoMate ExpressTM系统使用PrepFiler Express BTATM试剂盒由仪器检验；而目前国内外报道[3，7]骨骼DNA提取方法多使用有机溶剂等化学试剂。

在使用AutoMate ExpressTM系统提取骨骼DNA时，由于系统对样本消化后的消化液体积要求不能超过230μL，而骨粉会吸收裂解液，限制了能够使用的骨粉量。因此，建议在AutoMate ExpressTM系统上处理陈旧性骨骼，骨粉的最大量不宜超过0.2 g。PrepFiler BTATMLysis缓冲液需要375μL，才能保证56℃温浴后能吸取到230μL的上清液。

当用Identifiler®Plus试剂盒进行常规STR检验，只检出性别等小片段等位基因时，说明骨骼陈旧，DNA降解严重，DNA量少。这时可结合采用miniSTR检验，能显著提高微量、降解DNA的检出成功率[8]。

[1]胥少汀，徐印，葛宝丰.实用骨科学[M].3版.北京：人民军医出版社，2005：1892-1893.

[2]高林林，徐念来，谢炜，等.利用AutoMate ExpressTM自动化法医DNA提取系统提取骨骼及牙齿DNA[J].法医学杂志，2013，29（2）：127-129.

[3]MOSS D，HARBISON S A，SAUL D J.An easily automated，closed-tube forensic DNA extraction procedure using a thermostable proteinase[J].Int J Legal Med，2003，117（6）：340-349.

[4]贾东涛，韩海军，张玉红，等.陈旧骨骼DNA提取方法的应用研究[J].中国法医学杂志，2007，22（4）：260-261，封3.

[5]张杰，薛庆节，唐光峰，等.陈旧骨骼DNA提取[J].法医学杂志，2006，22（1）：72-73.

[6]叶健，季安全，郑秀芬，等.陈旧性骨骼DNA提取技术的研究[J].中国法医学杂志，2001，16（S1）：8-11.

[7]刘雅诚，王静，严江伟，等.硅珠法提取骨组织DNA[J].中国法医学杂志，2002，17（1）：38-40.

[8]王会品，刘超，孙宏钰.MiniSTR技术的研究进展[J].法医学杂志，2006，22（2）：152-159.

DNA Extraction from Old Bones by AutoMate ExpressTMSystem

LI Bin1,LÜZheng2
（1.Criminal Technology Agency of Fujian Province Public Security Department,Fuzhou 350003,China; 2.Gulou District Public Security Bureau of Fuzhou City,Fuzhou 350003,China）

Objective To establish a method for extracting DNA from old bones by AutoMate ExpressTMsystem.Methods Bones were grinded into powder by freeze-mill.After extraction by AutoMate ExpressTM, DNA were amplified and genotyped by Identifiler®Plus and MinFilerTMkits.Results DNA were extracted from 10 old bone samples,which kept in different environments with the postmortem interval from 10 to 20 years,in 3 hours by AutoMate ExpressTMsystem.Complete STR typing results were obtained from 8 samples.Conclusion AutoMate ExpressTMsystem can quickly and efficiently extract DNA from old bones,which can be applied in forensic practice.

forensic genetics;bone;DNA;AutoMate ExpressTMsystem

DF795.2

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2017.04.010

1004-5619（2017）04-0380-03

2015-08-06）

（本文编辑：柳 燕）

福建省自然科学基金资助项目（2014J01273）

李斌（1972—），女，博士，主任法医师，主要从事DNA检验及鉴定；E-mail：1378856710@qq.com