吴永恒++++++张孜君++++++黄岩++++++赵文

[摘要] 目的 以聚乳酸-聚乙醇酸（PLGA）制备新型缓释载药微球，携载骨生长因子2（BMP-2），研究其物理学特性以及在体内、体外对成骨的影响。 方法 采用复合复乳法制备载有BMP-2的PLGA缓释微球，检测形态、粒径、载药率、包封率、释药规律。观察其在体外环境下对骨髓间充质干细胞（BMSCs）增殖分化的影响，观察其在小鼠股部肌肉内异位成骨的情况。 结果 缓释微球的表面光滑，平均粒径为（242.2±31.3）μm，正態分布，微球的体外释药规律符合双相动力学释药规律。随着微球缓释量的增加，携载BMP-2的微球组细胞增殖明显加快（P < 0.05），BMP-2介导的BMSCs增殖呈浓度依赖性升高（P < 0.05）。微球体内成骨效果明显，4周后可见大量的骨小梁，并有骨髓腔形成。 结论 携载BMP-2的PLGA缓释微球具有良好的载药特性，可明显促进BMSCs增殖、分化、提高成骨活性。在骨组织工程研究中具有广阔的应用前景。

[关键词] 聚乳酸-聚乙醇酸；人骨形成蛋白；微球载体；成骨活性；骨组织工程

[中图分类号] R687.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）08（b）-0025-04

[Abstract] Objective To research the physical characteristics of novel bone morphogenetic factor-2 （BMP-2）-loaded poly （lactic-co-glycolic acid） （PLGA） microspheres with a sustained control release of BMP-2 for bone induction and the influence ossification in vitro and in vivo. Methods The BMP-2-loaded PLGA microspheres through double emulsion method was prepared， and the physiological properties of microspheres was investigated， including particle size and loading and encapsulation rates of BMP-2， and the release profile of BMP-2. The effects of BMP-2-loaded microspheres on the proliferation and differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells （BMSCs） in vitro and the ectopic bone formation inside the mouse thigh muscle were studied. Results The average size of PLGA particles loaded with BMP-2 was （242.2±31.3） μm with smooth surface. BMP-2 released from microspheres displayed a biphasic release profile. BMSCs cultured with BMP-2-loaded microspheres showed the fastest proliferation rate among all groups （P < 0.05）. The proliferation rate of BMSCs was dose-dependent on BMP-2 （P < 0.05）. Ectopic bone formation in the mouse thigh muscle was observed after injection of BMP-2-loaded-microspheres. A large number of trabecular bone appeared with emerging bone marrow cavity 4 weeks after the injection. Conclusion The new method to prepare PLGA microspheres loaded with BMP-2 has a sustained control release rate， which can promote the proliferation and differentiation of BMSCs in vitro and ectopic bone formation in vivo. BMP-2-loaded PLGA microsphere holds high potential for wide application in bone tissue regeneration.

[Key words] PLGA； BMP-2； Microspheres； Osteogenetic activity； Bone tissue

当前治疗骨折愈合不良或骨折不愈合主要是采用自体骨、同种异体骨移植。但异体骨移植常存在免疫排斥反应、原材料匮乏以及传播疾病等问题，而自体骨移植会给患者带来额外的伤害，并且供体有限。聚乳酸-聚乙醇酸共聚物（PLGA）是一种可降解的功能高分子有机化合物，具有良好的生物相容性、无毒、良好的成囊和成膜的性能，近年来被广泛用于构建成骨支架[1-2]。骨形态发生蛋白2（BMP-2）是骨修复中至关重要的生长因子[3-4]，但因其在体内的半衰期较短，不能持续维持局部有效浓度，故在临床应用中受到局限。本研究希望利用PLGA合成能够在治疗部位持续释放BMP-2的载药微球，并在治疗部位能够维持足够的浓度，调节细胞附着、迁移、增殖和分化，且具有良好的机械性能和无毒性[5-6]。endprint

1 材料与方法

1.1 制备BMP-2/PLGA载药微球

将浓度为10 mg/mL，含100 mg BMP-2溶液与含500 mg的1.25 mL PLGA二氯甲烷溶液中进行超声乳化。然后加入1%聚乙烯醇（PVA）2 mL，形成混合溶液，再乳化30 s，形成双乳液。再将此双乳液加入到浓度为0.3% PVA，100 mL水溶液和2%异丙醇100 mL水溶液中，搅拌混匀1 h[7-8]。离心后收集合成的微球，去离子水洗涤两次，真空干燥，儲存于-80°C低温冰箱。

1.2 检测BMP-2/PLGA载药微球的物理学性质

将少量微球均匀的分散在玻片上，保证显微镜下每视野微球计数不少于200个，测定每个微球的大小，并画出微球的粒径分布图。扫描电子显微镜观察微球形态。在37℃条件下将10 mg的微球置于pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液5 mL中，分别在开始温育后的2 h、8 h、24 h、2 d、4 d、7 d、14 d、21 d和28 d，取样1 mL，与同等体积的缓冲液充分混匀，用ELISA法测定不同时间点的BMP-2的释放量。

1.3 观察BMP-2/PLGA载药微球对体外培养BMSCs的作用

分离中华田园犬BMSCs。分为三组，分别加入的BMP-2蛋白（A组）、BMP-2/PLGA载药微球（B组）、无干预组（C组）。A组根据加入蛋白浓度不同，分为三个亚组：100、200、400 μg/mL分别对应A1组、A2组、A3组。B组根据加入载药微球浓度不同，分为三个亚组：100、200、400 μg/mL分别对应B1组、B2组、B3组。第1、3、5天采用MTT比色法测定BMSCs增殖情况。采用碱性磷酸酶（ALP）染色及定量检测法测定骨形成活性。

1.4 观察BMP-2/PLGA载药微球在体内的成骨作用

于24只雄性昆明小鼠[SPF级，普通饲养，北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号：SCXK（京）2014-0013]，其中12只股部肌肉内注射BMP-2蛋白，另外12只股部肌肉内植入BMP-2/PLGA载药微球50 mg，所有小鼠对侧植入不含BMP-2的PLGA微球50 mg作为对照。植入后2周，4周取股部肌肉，HE染色观察成骨情况。

1.5 统计学方法

采用统计软件SPSS 19.0对数据进行分析，正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。计数资料以率表示，采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BMP-2/PLGA载药微球物理学性质

干燥状态下载药微球粒径呈正态分布，粒径主要集中在110～340 μm，平均粒径为（242.2±31.3）μm（图1）。扫描电镜观察微球表面形态可见形态规整均匀，近似圆形（图2）。BMP-2的释放量见图3，第1天释放量为（14.2±0.71）%，表现为爆发性释放。随后表现为持续缓慢释放，28 d后可达（44.6±3.5）%。

2.2 BMP-2/PLGA载药微球对体外培养BMSCs的作用

BMSCs细胞增殖详见表1。在所有时间点，A、B组BMSCs增殖显著高于C组（P < 0.05），细胞增殖显示出剂量依赖性升高（P < 0.05）。在第1天，A1组细胞的增殖高于B1组（P < 0.05）。第3天A1与B1组，A2与B2组细胞增殖几乎相等。第5天同等浓度条件下B组细胞增殖显著高于A（P < 0.05）。ALP染色显示A组、B组BMSCs细胞表现出ALP阳染颗粒增多（图4）。

2.3 BMP-2/PLGA载药微球在体内的成骨作用

肌内植入物的组织学实验切片HE染色示：在2周见对照组中BMP-2周围少许软骨形成。实验组中可见周边弥漫性分布的钙化软骨形成；4周后可见对照组的BMP-2周围的软骨形成板层状骨和骨髓，而实验组中可见骨髓腔形成，并出现大量的骨小梁 （图5）。

3 讨论

相关研究表明，骨生长因子促进骨形成的前提是与适宜的载体缓释系统有效结合[2]。对于骨生长因子结合的载体缓释系统的探索大部分集中在固体（支架性）载体材料的研究方面[8-9]。本实验利用近年来广受关注PLGA作为载体材料来制备蛋白质和肽类微球的转运系统。通过复乳溶剂蒸发法制备W/O/W型PLGA微球，能较好的满足骨生长因子分散载体系统的要求，且利用白蛋白作为稳定剂可有效减少微球制备过程中的有机溶剂对BMP活性的影响[10-13]。根据相关研究表明，稳定剂可以作为饱和水相与有机相的界面的介质从而防止BMP与有机溶剂等不利因素的直接接触[14-15]。在体外试验方面，使用PBS体外模拟药物释放动力学结果表明微球在体外释药方面能够满足双相药物释放动力学的规律，且初相与位于微球表面BMP-2的解吸有关，而后相与由微球缓慢降解有关[16]。

本实验将 BMP-2加载到PLGA微球上，平均粒径为（242.2±31.3）μm，此种孔隙对骨形成来说是最佳的[17-18]。在骨缺损的治疗中，相比短效的BMP-2的植入物，长效缓释BMP-2的PLGA微球系统能够更明显有效的增强骨骼生长；含有相同剂量BMP-2的长效和短效BMP-2载体在体内表现为：长时间释放BMP-2的载体更能促进BMP-2的成骨效果[9]。有效的载体可以在应用部位持续释放BMP-2，在体内具有生物活性的BMP-2持续释放的时间越长，骨修复就会表现的更快和更完整[10-11]；另外，研究发现，具有生物活性的BMP-2可以从长效载体中持续且长期释放。本实验中，具有生物活性的BMP-2体外释放持续至少42～84 d，BMP-2释放呈现为双相动力学药物释放的规律，BMP-2的释放不仅可被控制而且其活性不受影响。虽然BMP-2可以强烈诱导骨生长并且能促进在皮下、肌肉、体内脂肪处出现异位骨形成，但是，当BMP-2的载体作为骨修复材料出现时目前仍没有明确它的合适剂量[12]。相关研究结果显示剂量为50 mg的BMP-2能够诱导大鼠肌肉注射部位的异位骨形成[19-20]，且在急性创伤中给予外源性BMP后，BMP很快被代谢掉，因此有必要提供高剂量的BMP。然而尚有以下几点尚需进一步研究：①目前由于对BMP-2的特异性定量较为困难，不能了解微球在体内的释药特性，仅在细胞培养中得到的数据只能作为一种参考。②本实验未进一步行动物实验，下一步应将BMP-2/PLGA微球应用于动物骨折模型进行研究，并着重解决液态制剂注射到骨折局部后防止流溢问题，可以尝试使用具凝固能力的液体（如纤维蛋白胶）作为BMP-2/PLGA微球的分散剂达到目的。endprint

本研究探索出攜载BMP-2-PLGA微球的最佳制备方法，其体外药物释放实验表明PLGA微球具有良好的缓释效果，对骨髓基质细胞增殖和ALP活性的作用效果优于单独应用BMP-2，适合于有效骨的形成，成为骨再生的一种有效治疗方式。

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