李华萍+孙圣荣+陈创+汪媛

[摘要] 目的 研究多聚蛋白-2（MMRN2）在乳腺癌中的表达及对预后的影响，探讨其在乳腺癌发病机制中的作用。 方法 收集2013年1月～2017年4月在武汉大学人民医院行手术切除的乳腺浸润性导管癌标本和癌旁组织50例，采用Western blot和qRT-PCR检测MMRN2的表达情况，分析MMRN2表达量高低与患者病理特征及预后的关系。 结果 MMRN2在乳腺癌组织中低表达（P < 0.01），MMRN2表达量高低与患者病理特征无明显相关性（P > 0.05），MMRN2高表达可以延长乳腺癌患者总生存期（P=0.036）和无复发生存期（P=0.019）。 结论 MMRN2是乳腺癌的抑癌基因，可以作为一个潜在的乳腺癌分子治疗靶点，提高患者生存期。

[关键词] 多聚蛋白-2；乳腺癌；抑癌基因；预后

[中图分类号] R737.9 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）08（b）-0004-04

[Abstract] Objective To investigate the expression of MMRN2 in breast cancer and its influence on prognosis， discuss the mechanism of MMRN2 in breast cancer. Methods Western blot and qRT-PCR were used to detect the expression of MMRN2 in 50 pairs of human breast invasive ductal carcinoma specimens and adjacent tissues， which had excision by surgery in Renmin Hospital of Wuhan University from January 2013 to April 2017. The relationship between the expression of MMRN2 and the pathologic features and prognosis of patients were analyzed. Results The expression of MMRN2 in breast cancer was down-regulated （P < 0.01）， and the expression of MMRN2 was not correlated with the pathological characteristics of patients （P > 0.05）. Up-regulated MMRN2 could prolong the overall survival （P = 0.036） and no recurrence survival time （P = 0.019） of patients with breast cancer. Conclusion MMRN2 is a tumor suppressor gene for breast cancer， and can serve as a potential target for molecular treatment of breast cancer， improve patients′ survival.

[Key words] MMRN2； Breast cancer； Anti-oncogene； Prognosis

乳腺癌是严重威胁女性健康与生命最常见的恶性肿瘤之一，其中乳腺浸润性导管癌多发[1]。近年来我国乳腺癌发病率呈逐年上升趋势。全球最新数据显示，乳腺癌致死率在女性恶性肿瘤中排位第2位[2]。乳腺癌是一种异质性肿瘤，在分子表型、生物学、治疗敏感性等方面存在着多样性[3]。尽管雌激素受体内分泌治疗在乳腺癌临床控制中发挥着重要作用，然而内分泌治疗耐药和三阴性乳腺癌的问题大大减弱了其治疗效果[4]。因此，寻求新的靶点，用分子生物学方法治疗乳腺癌是目前研究的热点。本研究分析了乳腺癌患者多聚蛋白-2（multimerin2，MMRN2）的表达情况，并观察其与病理特征的关系，为分子靶向治疗乳癌提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 组织标本

选择2013年1月～2017年4月于武汉大学人民医院普外科行手术切除的乳癌组织标本50例，并取同一病例的癌旁组织（距离癌组织>2 cm的乳腺组织）。术前患者均未接受任何放化疗、内分泌治疗，术后病理结果证实为浸润性导管癌。患者均为女性，由病理学家根据世界卫生组织标准[5]进行乳腺癌分级。标本的获取经武汉大学人民医院伦理委员会审批，研究严格按照道德规范进行设计和实施，参与者均签署知情同意书。所有标本获取后用生理盐水去除血渍，装入冻存管后迅速保存于液氮中。

1.2 实时定量聚合酶链反应

取黄豆大小的组织标本液氮研磨至粉末状，装入1.5 mL离心管，加入1 mL Trizol置于室温下裂解15 min，然后加入200 mL氯仿剧烈震荡后冰上静置10 min，4℃ 12000 r/min离心15 min。吸取上清液装入干净离心管中并加入等体积的异丙醇，轻轻混匀，-20℃静置20 min。4℃ 12000 r/min离心15 min弃上清液，配置75%乙醇溶液洗涤沉淀物2遍，用无RNA酶超纯水溶解。使用Nandrop分光光度计（Thermo，美国）测量RNA浓度和纯度。采用高效率逆转录试剂盒（QPK-201，日本）将RNA逆转为cDNA，置于-20℃保存。按照Takara qRT-PCR試剂盒说明书进行操作，设立3个复孔，甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参基因，采用实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测各基因的表达量。按95℃ 10 min，90℃ 10 s，56℃ 30 s，72℃ 40 s，40个循环进行扩增，7500 Fast System SDS软件（BIO-RAD，美国）分析Ct值，数据分析采用2-ΔΔCT计算方法。引物序列由武汉巴菲尔生物有限公司设计合成，详见表1。endprint

1.3 蛋白质免疫印迹（Western blot）实验

采用液氮碾磨法将乳腺癌组织磨至粉末状，加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液置于冰上充分裂解细胞15 min，4℃ 12000 r/min离心5 min，获取细胞总蛋白，用BCA试剂盒测定蛋白浓度，按照1∶1的比例加适量的上样缓冲液（loading buffer），沸水浴煮10 min使蛋白变性，置于-80℃保存。制备SDS-PAGE凝胶，根据蛋白浓度计算出上样体积，加样。60 mA恒流电泳约1 h，转膜，封闭，MMRN2一抗过夜孵育（Abbexa，北京），二抗（生物素标记山羊抗兔IgG 1∶10000）孵育，漂洗，经ECL试剂盒（BestBio，上海）显色，凝胶成像系统（BIO-RAD，美国）扫描处理。

1.4 生物信息学

运用Blast软件（http：//blast.ncbi.nlm.nih. gov/Blast.cgi）设计MMRN2的引物。采用Kaplan-Meier plotter软件（http：//kmplot.com/analysis/index.php？p=service&cancer=breast）预测MMRN2表达高低与乳腺癌患者预后的关系。

1.5 统计学方法

所有图表运用GraphPad Prism 5（GraphPad Software，CA，USA）制作。采用IBM SPSS 20.0（IBM，USA）统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验；生存分析采用Kaplan-Meier分析和log-rank檢验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乳腺癌组织中MMRN2 mRNA水平

测定50例乳腺浸润性导管癌和对应癌旁组织中MMRN2的表达量。结果表明，MMRN2 mRNA在乳腺浸润性导管癌标本中表达量明显低于癌旁组织（P < 0.01）。见图1。另外，分析MMRN2的表达水平与临床病理特征的关系显示，MMRN2表达量高低与患者年龄、肿瘤直径、淋巴结转移、组织学分级无显著相关性（P > 0.05）。见表2。

2.2 乳腺癌组织中MMRN2蛋白水平

运用Western blot检测乳腺浸润性导管癌和对应癌旁组织总蛋白中MMRN2的表达量，结果表明：乳腺癌组织中MMRN2的蛋白表达量明显低于癌旁组织（P < 0.05），提示MMRN2在乳腺癌中低表达。见图2。

2.3 MMRN2表达高低与患者预后的关系

采用Kaplan-Meier plotter软件预测MMRN2表达高低与616例患者总生存期（overall survival，OS）和1764例患者无复发生存期（recurrence-free survival，RFS）的情况。结果提示：MMRN2高表达的OS（logrank P=0.036）和RFS（logrank P=0.019）均高于MMRN2低表达的患者，差异有统计学意义。见图3。

3 讨论

乳腺癌是一种异质性疾病，不同的亚型具有不同的分子生物学和临床过程。标准临床和病理特征的评估传统上用于确定在乳腺癌患者中是否使用辅助全身治疗[6]。然而，通过识别特征，让患者从辅助化疗中受益仍然是一个挑战，可能导致一些患者过度治疗。分子医学的进步大大提高了乳腺肿瘤基因表达谱的准确性，从而改善了预测患者乳腺癌复发风险的准确性和对内分泌治疗和/或化学疗法的可能反应能力[7-9]。基因组测定可辅助医生在个体水平上为患者制订个性化治疗方案。目前通过检测乳腺癌患者预后相关的基因，开发基因治疗法，可直接或间接通过刺激抗肿瘤免疫行特异性靶向癌细胞治疗。

MMRN2是与细胞表面紧密相关的ECM糖蛋白，包含p125、p140、p110和p200 4个不同的二硫键合亚基，具有信号肽、N末端EMI结构域和由中心卷曲螺旋富含区域分离的C末端C1q结构域的EMILIN样蛋白[10]。MMRN2在正常和肿瘤血管系统中广泛表达，是某些肿瘤中新血管形成的研究热点[11]。MMRN2特别保存在内皮细胞中，与血管紧密排列，并且存在于血管的腔侧[12]。然而，直到最近，MMRN2在血管生成和内皮细胞中的功能仍然难以捉摸[13]。Lorenzon等[11]最近发现了MMRN2的抗血管生成作用，它抑制内皮细胞迁移和血管组织而不影响增殖。MMRN2剂量依赖性地损害了成纤维细胞/内皮细胞共培养系统中微血管的形成，并大大减少了大鼠主动脉环的血管发芽[14]。在体内，MMRN2在钙调素测定中抑制含血管内皮生长因子（VEGF）海绵体的血管生成发芽，但不抑制含有b-FGF的海绵70。实际上，MMRN2被发现直接结合VEGF-A，并干扰内皮细胞中的VEGF/VEGFR2信号传导[15-16]。MMRN2取代了与HUVEC细胞结合的放射性标记VEGF，表明蛋白质干扰VEGF-VEGFR结合[12，17]。与MMRN2与内皮细胞表面密切相关的事实一致，MMRN2的细胞周期蛋白浓度很可能是富集的，并且是VEGF结合VEGFR2隔离和调节VEGF活性的重要竞争者。HT1080人纤维肉瘤细胞中MMRN2的稳定过表达通过抑制肿瘤血管生成显著抑制裸鼠异种移植肿瘤生长[18]。直接肿瘤内注射重组MMRN2腺病毒也导致肿瘤抑制和抗血管生成作用，但程度较低。MMRN2作为一种血管生成抑制剂有几个关键特征：首先，虽然MMRN2表现出泛内皮表达，但似乎并不影响正常的内皮细胞生长、增殖或凋亡。其次，MMRN2具有独特的VEGF隔离机制，这种分子可以用来限制局部血管发生，以保持静止状态，或在病理状态下作为VEGF信号的反馈调节剂。实际上，大多数ECM成员隔离VEGF也影响内皮细胞增殖[19-20]，但MMRN2表现出独特的抑制作用，仅限于内皮细胞运动。最后，MMRN2对肿瘤生长和血管生成的影响开启了将MMRN2开发成用于癌症治疗的新抗血管生成药物的可能性。endprint

本文研究發现，MMRN2在乳腺癌中显著低表达，且高表达患者预后优于低表达者，证明了MMRN2是乳腺癌的抑癌基因。可见，MMRN2可能参与了乳癌的浸润与转移。今后应行体内体外实验进一步揭示乳癌发生及浸润转移机制，寻找预测转移指标，为指导临床靶向治疗乳癌提供初步的实验依据。

[参考文献]

[1] Beretov J，Wasinger VC，Graham PH，et al. Proteomics for breast cancer urine biomarkers [J]. Adv Clin Chem，2014， 63：123-167.

[2] Siegel RL，Miller KD，Jemal A. Cancer statistics，2017 [J]. CA Cancer J Clin，2017，67（1）：7-30.

[3] Cancer Genome Atlas Network.Comprehensive molecular portraits of human breast tumours [J]. Nature，2012，490（7418）：61-70.

[4] Germain D. Estrogen carcinogenesis in breast cancer [J]. Edodocrinol Metab Clin North Am，2011，40（3）：473-484.

[5] Yang SN，Li FJ，Chen JM，et al. Kinetic Curve Type Assessment for Classification of Breast Lesions Using Dynamic Contrast-Enhanced MR Imaging [J]. PLoS One，2016， 1（4）：e0152827.

[6] Julia B，Valerie C，Ewan K，et al. Proteomic Analysis of Urine to Identify Breast Cancer Biomarker Candidates Using a Label-Free LC-MS/MS Approach [J]. PLoS One，2015， 10（11）：e0141876.

[7] Lei T，Zhao X，Jin S，et al. Discovery of Potential Bladder Cancer Biomarkers by Comparative Urine Proteomics and Analysis [J]. Clin Genitour Cancer，2013，11（1）：56-62.

[8] Hassanein M，Callison JC，Callaway-Lane C，et al. The state of molecular biomarkers for the early detection of lung cancer [J]. Cancer Prevention Res，2012，5（8）：992-1006.

[9] Beretov J，Wasinger VC，Graham PH，et al. Proteomics for breast cancer urine biomarkers [J]. Adv Clin Chem，2014， 63：123-167.

[10] Rao N，Lee YF，Ge RW. Novel endogenous angiogenesis inhibitors and their therapeutic potential [J]. Acta Pharmacot Sin，2015，36（10）：1177-1190.

[11] Lorenzon E，Colladel R，Andreuzzi E，et al. MULTIMERIN2 impairs tumor angiogenesis and growth by interfering with VEGF-A/VEGFR2 pathway [J]. Oncogene，2012，31（26）：3136-3147.

[12] Welch-Reardon KM，Ehsan SM，Wang K，et al. Angiogenic sprouting is regulated by endothelial cell expression of Slug [J]. J Cell Sci，2014，127（Pt 9）：2017-2018.

[13] Yuan BQ，Xian RH，Ma JF，et al. Isthmin inhibits glioma growth through antiangiogenesis in vivo [J]. J Neuro Oncol，2012，109（2）：245-252.

[14] Van Buul JD，Geerts D，Huveneers S. Rho GAPs and GEFs： controling switches in endothelial cell adhesion [J]. Cell Adh Migr，2014，8（2）：108-124.

[15] Noy PJ，Lodhia P，Khan K，et al. Blocking CLEC14A-MMRN2 binding inhibits sprouting angiogenesis and tumour growth [J]. Oncogene，2015，34（47）：5821-5831.

[16] Blanco R，Gerhardt H. VEGF and Notch in tip and stalk cell selection [J]. Cold Spring Harb Perspect Med，2013， 3（1）：a006569.

[17] Chang GH，Lay AJ，Ting KK，et al. ARHGAP18： an endogenous inhibitor of angiogenesis， limiting tip formation and stabilizing junctions [J]. Small GTPases，2014，5（3）：1-15.

[18] Baker M，Robinson SD，Lechertier T，et al. Use of the mouse aortic ring assay to study angiogenesis [J]. Nat Protoc，2011，7（1）：89-104.

[19] De Angelis JE，Lagendijk AK，Chen H，et al. Tmem2 regulates embryonic vegf Signaling by controlling hyaluronic acid turnover [J]. dev cell，2017，40（2）：123-136.

[20] Andreuzzi E，Colladel R，Pellicani R，et al. The angiostatic molecule multimerin 2 is processed by MMP-9 to allow sprouting angiogenesis [J]. Matr Biol，2017.DOI：10.1016/j.matbio.2017.04.002endprint