雷莉妍，王瑞成，谢培，张丹丹，唐志书，宋忠兴

(1.陕西中医药大学 陕西省中药资源产业化协同创新中心 陕西省中药基础与新药研究重点实验室，陕西 咸阳 712083；2.陕西中医药大学 附属医院，陕西 咸阳 712000；3.陕西中医药 大学药学院，陕西 咸阳 712000)

·基础研究·

玉女煎对大鼠佐剂性关节炎的治疗作用及机制研究△

雷莉妍1*，王瑞成2，谢培1，张丹丹3，唐志书1，宋忠兴1

(1.陕西中医药大学 陕西省中药资源产业化协同创新中心 陕西省中药基础与新药研究重点实验室，陕西 咸阳 712083；2.陕西中医药大学 附属医院，陕西 咸阳 712000；3.陕西中医药 大学药学院，陕西 咸阳 712000)

目的：观察玉女煎对大鼠佐剂性关节炎的干预作用及可能的作用机制。方法：在整体动物水平，采用完全弗氏佐剂诱导大鼠关节炎模型，大鼠随机分为正常组、关节炎模型组、雷公藤多苷阳性对照组、YNJ 高剂量组(6.1 g生药·kg-1)、YNJ中剂量组(3 g生药·kg-1)、YNJ 低剂量组(1.5 g生药·kg-1)，分别测定大鼠的体质量、足肿胀度，并通过ELISA法检测血清中的IL-1、IL-6、TNF-α及PGE2水平。在细胞水平，采用IL-1诱导人成纤维样滑膜细胞HFLS炎症模型，ELISA法检测细胞上清中IL-6及TNF-α生成量。结果：玉女煎能有效地恢复炎症诱导的体质量降低，改善足肿胀程度，在动物和细胞水平均能显著抑制相关炎症因子的表达。结论：玉女煎具有显著的抗大鼠佐剂性关节炎活性，可能通过抑制炎症因子的表达发挥作用。

类风湿性关节炎；佐剂性关节炎；玉女煎；抗炎；炎症因子

玉女煎系载于《景岳全书》的一首古方，由生石膏、熟地黄、知母、麦冬、牛膝5味中药组成，具有清胃泻火、滋阴增液的功能，在临床上多用于治疗牙周炎、口腔溃疡、糖尿病等炎症相关疾病。近年来，研究发现，加减玉女煎对实验性心室重构和实验性甲状腺功能亢进有显著的改善作用[1-2]，加味玉女煎对退行性膝关节炎也有显著的治疗效果[3]。类风湿性关节炎是一种自身免疫障碍引起的慢性炎症[4]，佐剂性关节炎(adjuvant arthritis，AA)是一种与人类风湿性关节炎病理极为相似的一种免疫炎症模型[5]。本实验拟采用AA大鼠模型，观察玉女煎对类风湿关节炎的影响，并通过成纤维样滑膜细胞炎症模型探讨其可能的作用机制。

1 材料与仪器

1.1 动物

清洁级雄性SD大鼠，体质量(200±20)g，购于西安交通大学医学部实验动物中心，许可证号：SCXK(陕)2012-003。动物购回后，正常喂养一周以适应实验条件。在此期间，所有大鼠可自由进食及饮水。本研究所有动物实验均按照当地动物实验伦理要求进行。

1.2 主要材料及试剂

石膏、知母、熟地黄、牛膝及麦冬(陕西兴盛德药业有限责任公司)；雷公藤多苷片(上海复旦复华药业有限公司，批号：150308)；完全弗氏佐剂(美国Sigma公司)；大鼠源IL-1、IL-6、TNF-α和PGE2、ELISA检测试剂盒，人源IL-6、TNF-α的ELISA检测试剂盒均购自美国ADL公司；人成纤维样滑膜细胞(美国ATCC)；DMEM高糖培养基(美国Hyclone公司)；胎牛血清(浙江天航生物科技有限公司)；青链霉素混合液(北京索莱宝科技有限公司)。

1.3 主要仪器

全波长酶标仪(美国Biotek)；低速离心机(上海安亭科学仪器厂)；循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；大小鼠足趾容积测量仪(美国IITC公司)；细胞培养箱(美国Thermo公司)；旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；调温型电热套(北京科伟永兴仪器有限公司)。

2 方法

2.1 玉女煎干粉的制备

分别精确称取15 g 生石膏，30 g熟地黄，6 g麦冬，5 g知母，5 g牛膝，加10倍水浸泡40 min，加热回流提取1 h，过滤，滤渣再加8倍量水加热回流提取1 h，再次过滤，合并两次滤液并进行浓缩，最后经冷冻干燥后制成干粉，备用。

2.2 动物实验

2.2.1大鼠佐剂性关节炎的建立 SD大鼠适应实验条件1周后，随机抽取10只标记为正常对照组，左后足趾皮内注射0.1 mL 0.9%氯化钠溶液。另取50只大鼠，左后足趾皮内注射完全弗氏佐剂(Freund’s Complete Adjuvent，FCA)0.1 mL诱导佐剂性关节炎。

2.2.2 给药方案 经完全弗氏佐剂处理的大鼠随机分为5组，即AA模型组、阳性对照组、YNJ 高剂量组(6.1 g生药·kg-1，根据日处方量和大鼠与人体表比换算法计算剂量，相当于4.36 g干粉·kg-1)，YNJ 中剂量组(3 g生药·kg-1，相当于2.14 g干粉·kg-1)，YNJ 低剂量组(1.5 g生药·kg-1，相当于1.07 g干粉·kg-1)，每组10只。从致炎后第12 d开始，各组大鼠灌胃给药，正常组和模型组给相同体积的纯净水，阳性药物组给予30 mg·kg-1的雷公藤多苷，治疗组给予不同剂量的玉女煎。

2.2.3 观察指标

2.2.3.1 体质量 在致炎前测量大鼠体重，并在AA大鼠出现继发性足肿反应时，每4天测量1次体质量，观察玉女煎对佐剂性关节炎大鼠体质量的影响。

2.2.3.2 肿胀度测量 在AA大鼠出现继发性足肿胀反应时，采用大鼠足肿胀仪每4天测量1次右后足踝关节标记线下的足趾体积，以该值与致炎前同侧足趾体积差值作为评价足肿胀程度的指标。

2.2.3.3 血清炎症指标 在第28 d时，水合氯醛麻醉大鼠，于腹腔静脉取血，并3000 r·min-1离心10 min，取上清液，用ELISA试剂盒检测血清中的IL-1、IL-6、TNF-α及PGE2水平。

2.3 细胞实验

2.3.1 细胞培养 人成纤维样滑膜细胞HFLS培养在DMEM高糖培养基(含10% 胎牛血清，100 U·L-1青霉素和100 mg·L-1链霉素)中，于37 ℃ CO2的恒温培养箱内培养。待细胞生长至90%汇合时，用含血清的新鲜培养基吹打细胞，并以1∶2的密度进行传代。

2.3.2 MTT实验 HFLS细胞以2×104个/孔的密度接种于96孔板中，待细胞完全贴壁后，弃去培养基，用不同浓度的玉女煎处理细胞24 h。在细胞培养结束前4 h，每孔加入15 μL的MTT。培养结束后，吸去培养基，每孔加入150 μL的DMSO，用多功能酶标仪检测450 nm处吸光度值，选择对细胞生存无影响的药物浓度进行后续实验。

2.3.3 IL-1诱导HFLS细胞炎症模型 HFLS细胞以2×104个/孔的密度接种于96孔板中，细胞完全贴壁后，弃去旧培养基，用2.0 ng·mL-1IL-1和不同浓度的玉女煎处理细胞24 h。取上清液，ELISA法检测上清液中IL-6和TNF-α含量。

2.4 统计学处理

3 结果

3.1 玉女煎干粉的制备及分析

玉女煎原方生药总量为61 g，经提取干燥后得43.6 g干粉，并通过HPLC研究了玉女煎提取物的指纹图谱[6]，确认了5个代表性化学成分，分别是5-羟甲基糠醛、芒果苷、毛蕊花糖苷、蜕皮甾酮、甲基麦冬二氢高异黄酮A。

3.2 玉女煎对佐剂性关节炎大鼠体质量的影响

AA大鼠由于继发性的炎症，导致倦怠、食欲下降，体质量也会发生变化。如图1所示，与正常组相比，AA模型大鼠的体质量下降，在第16天时差异具有统计学意义(P<0.05)。YNJ 高剂量、中剂量组及阳性药物雷公藤多苷治疗组可改善体质量的下降状况，第28天时YNJ 高剂量组与模型组体质量相比，差异具有统计学意义(P<0.01)。

注：与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；n=10；下同。图1 玉女煎对AA大鼠体质量的影响

3.3 玉女煎对佐剂性关节炎大鼠继发性足肿胀的影响

完全佐剂关节炎模型在造模后第12 d会出现继发性足肿胀。如图2所示，与正常组相比，AA模型组大鼠第12 d右后足趾出现显著的继发性足肿胀(P<0.01)。YNJ高剂量组可明显抑制佐剂诱导的继发性足肿胀，在第24天时与模型组相比均具有统计学差异(P<0.01)。

图2 玉女煎对AA大鼠继发性足肿胀的影响

3.4 玉女煎对佐剂性关节炎大鼠血清相关炎症指标的影响

与正常组相比，AA 模型组大鼠血清中IL-1、IL-6、TNF-α和PGE2 的含量均显著提高，见图3。玉女煎高剂量治疗组大鼠血清中各炎症指标水平均出现降低，与模型组相比差异具有统计学意义。

3.5 玉女煎对IL-1诱导HFLS细胞TNF-α及IL-6生成的影响

我们首先通过MTT实验研究玉女煎对HFLS细胞存活的影响。结果显示，当玉女煎给药浓度高于6 mg干粉·mL-1(相当于8.39 mg生药·mL-1)时，表现出一定的细胞增殖活性。因此，我们选择无细胞增殖活性的2 mg干粉·mL-1(相当于2.80 mg生药·mL-1)、4 mg干粉·mL-1(相当于5.60 mg生药·mL-1)和6 mg干粉·mL-1(相当于8.40 mg生药·mL-1)3个质量浓度研究玉女煎对IL-1诱导的HFLS人滑膜细胞TNF-α及IL-6的影响。研究结果显示，玉女煎能以质量浓度依赖的方式显著抑制IL-1诱导的TNF-α及IL-6生成(P<0.05)，见图4。

4 讨论

由于病机不明确，且临床表现复杂，目前对于类风湿性关节炎尚无理想的治疗方案。AA是一种免疫制剂诱导的免疫亢进性炎症模型，目前常作为人类风湿关节炎的实验模型。

AA大鼠由于倦怠、食欲下降等会导致体质量减轻。本研究显示玉女煎可显著改善炎症诱导的AA大鼠体重降低。完全佐剂诱导的大鼠足肿胀在12 d时会出现继发性肿胀。结果显示，玉女煎对继发性足肿胀具有很好的抑制作用，越来越多的研究显示细胞因子在该疾病的发生及发展过程中发挥着重要的作用。IL-1能刺激B淋巴细胞产生抗体量增加，同时还能诱导PGE2 胶原酶的产生[7]；TNF-α是类风湿关节炎关键的炎症细胞因子，可通过刺激蛋白多糖的吸收并抑制其合成进而促使

注：A.血清中IL-1质量浓度；B.血清中IL-6质量浓度；C.血清中TNF-α质量浓度；D.血清中PGE2质量浓度。图3 玉女煎对AA大鼠血清炎症因子的影响

注：A.细胞上清液中TNF-α质量浓度；B.细胞上清液中IL-6质量浓度。图4 玉女煎对IL-1诱导HFLS细胞炎症因子分泌的影响

软骨降解[8]；IL-1和TNF-α可诱导IL-6分泌，而IL-6能刺激活化的B细胞增殖[9]。本研究结果显示，与正常组相比，AA模型组大鼠血清中的炎症细胞因子IL-1、IL-6、TNF-α及PGE2水平均显著升高，玉女煎可降低完全佐剂诱导的炎症指标，改善炎症状况。

随后，我们用成纤维样滑膜细胞HFLS对玉女煎抗炎的作用机制进行了初步探讨。本实验采用IL-1诱导HFLS炎症，并对TNF-α和IL-6水平进行了检测。玉女煎能显著抑制IL-1诱导的TNF-α和IL-6生成。IL-6、TNF-α及IL-1等都是NF-κB的重要下游基因。这进一步说明，玉女煎可能通过抑制炎症因子的分泌发挥抗炎作用。

综上所述，玉女煎对大鼠佐剂性关节炎有一定的治疗作用，该作用可能是通过抑制相关炎症因子分泌发挥作用，本结果将为玉女煎治疗类风湿性关节炎作用机制的研究提供实验基础。

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StudyonEffectandMechanismofYunüjianonAdjuvantArthritisRat

LEILiyan1*，WANGRuicheng2，XIEPei1，ZHANGDandan3，TANGZhishu1，SONGZhongxing1

(1.ShaanxiUniversityofChineseMedicine/ShaanxiCollaborativeInnovationCenterofChineseMedicinalResourcesIndustrialization，ShaanxiprovincekeylaboratoryofnewdrugsandChinesemedicinefoundationresearch，Xianyang712083，China； 2.TheAffiliatedHospitaltoShaanxiUniversityofChineseMedicine，Xianyang712000，China； 3.SchoolofPharmacy，ShaanxiUniversityofChineseMedicine，Xianyang712000，China)

Objective：To investigate the effect and mechanism of Yunüjian on the arthritic rat.Methods：The adjuvant arthritis rat model was established by injecting the complete Frund’s adjuvant into the subcutis of their left rear paws.Rats were randomly divided into control group，adjuvant arthritis(AA)model group，tripterygium glycosides group，Yunüjian high-dose(6.1 g herbs·kg-1)group，Yunüjian middle-dose(3 g herbs·kg-1)group，and Yunüjian low-dose(1.5 g herbs·kg-1)group.The volume of paw swelling was detected，and the serum levels of IL-1，IL-6，TNF-α and PGE2 were measured by ELISA.HFLS cells were treated by IL-1，generation of IL-6 and TNF-α was detected by ELISA assay.Results：Yunüjian remarkably inhibited the reduction of body weight，decreased the swelling degree of the rat paws，and decreased the concentration of inflammatory factor.Conclusion：Yunüjian has a notable anti-inflammation activity，possibly through inhibition the expression of inflammatory factors.

Rheumatoid arthritis；adjuvant arthritis；Yunüjian；anti-inflammatory effect；inflammatory factor

陕西中医药大学重点培育项目(2015PY08)；陕西省中医管理局中医药科研基金项目(15-ZY009)；陕西省重点科技创新团队(2012KTC-20)；陕西省科技资源开放共享平台项目(2015FWPT-01)

] 雷莉妍，博士，讲师，研究方向：中药活性成分筛选与作用机理研究；E-mail：liyanlei-2005@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.2.007

2016-06-12)

*[