刘长虹，李永辉，李佩佩

(1.涞源县中医院，河北 涞源 074300；2.海南医学院 药学院，海南 海口 571199)

·基础研究·

益智中圆柚酮对慢性肾损伤的保护作用△

刘长虹1，李永辉2*，李佩佩2

(1.涞源县中医院，河北 涞源074300；2.海南医学院 药学院，海南 海口571199)

目的：评价益智中圆柚酮对慢性肾损伤的保护作用，阐述益智补肾缩尿的物质基础。方法：采用腺嘌呤诱导的CKD大鼠模型，对益智中圆柚酮的肾损伤保护作用进行研究，分别测定24h尿量、尿蛋白(UP24h)、血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)、硫酸吲哚醇(IS)的含量以及对肾脏病理切片进行观察，以确定圆柚酮对CKD的保护作用。结果：与模型组比较，圆柚酮各剂量组大鼠肾组织病理切片形态均有不同程度的改善，其中圆柚酮高剂量组>圆柚酮中剂量组>黄葵胶囊组>圆柚酮低剂量组，且高剂量组大鼠血清中BUN和IS及尿蛋白含量中低剂量组降低更明显；与高剂量组相比，中剂量组血清中Scr降低较明显。结论：圆柚酮对CKD呈现明显的量效关系，高剂量组对慢性肾损伤的保护作用强于低剂量组。

益智；圆柚酮；慢性肾损伤；保护作用；病理切片

慢性肾脏疾病(Chronic Kidney Disease，CKD)是一种多种原因诱导肾脏功能下降的疾病，近年来发病率呈现逐年上升的趋势，现已成为影响人类健康的一类常见病和多发病[1-3]。目前，慢性肾病的治疗主要为控制患者症状，降低蛋白尿的形成，在临床上取得了一定的疗效，但仍有较多的患者疗效不佳。肾脏疾病的临床研究发现，中药在改善患者临床症状、控制蛋白尿、减少血尿、保护肾功能和减轻化学药的副作用方面呈现了较好的优势[4]。

益智为姜科山姜属植物益智AlpiniaoxyphyllaMiq.的干燥成熟果实，性温，味辛，归脾、肾经，具有暖肾固精缩尿、温脾止泻摄唾的功效。临床上用于治疗冷气腹痛，中寒吐泻，多唾，遗精，小便余沥，夜多小便等证。益智作为传统肾脏用药[5-7]，在临床上广泛用于慢性肾脏疾病的治疗，然而对其药效物质基础及作用机制研究甚少。本课题组在多年益智研究工作的基础上，发现其主要成分圆柚酮对CKD具有较好的治疗作用，圆柚酮化学结构见图1。因此，本实验以腺嘌呤诱导的大鼠肾损伤模型，评价圆柚酮对慢性肾损伤的保护作用，以期阐明益智补肾缩尿的物质基础及其作用机制，为益智的临床应用提供实验支撑。

图1 圆柚酮化学结构

1 材料

1.1动物

健康SD雄性大鼠48只，体重180～220g，SPF级，长沙市天勤生物技术有限公司提供，合格证号为SCXK(湘)2009-0012，常规适应性饲养1周，无不良反应者进入实验。

1.2药品与试剂

圆柚酮(海南医学院，HPLC含量大于98%)；黄葵胶囊(江苏苏中药业集团，批号：15052703)；尿素氮试剂盒(批号：20150605)及肌酐试剂盒(批号：20150616)、尿蛋白定量试剂(批号：2150603)均由南京建成生物工程研究所提供；腺嘌呤(RealJimer，批号：641255)。其他试剂购于上海化学试剂公司。

1.3仪器

GS-15R型低温离心机(Beckman公司)；DW-40L262型低温冰箱(青岛海尔集团)；PL203型电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；e2695液相色谱仪(Waters公司)。

2 方法

2.1造模

取SD大鼠(180～220g)，随机分为6组，分别为正常组、模型组、黄葵胶囊组、圆柚酮高剂量组、圆柚酮中剂量组和圆柚酮低剂量组，模型组和实验组大鼠按150mg·kg-1灌胃腺嘌呤混悬溶液造模，连续造模14d后，将大鼠置于代谢笼中，分别收集正常组、模型组和实验组的24h尿量，模型组和实验组24h尿量大于正常组为造模成功。正常组给予0.9%氯化钠溶液，模型组继续按照150mg·kg-1腺嘌呤灌胃，实验组同时给予150mg·kg-1的腺嘌呤溶液和圆柚酮不同质量浓度的样品溶液。

2.2分组及给药

模型成功后，将大鼠48只随机分为6组，即正常组，模型组，阳性药物组，圆柚酮化合物高、中、低3个剂量组，每组8只。正常组(灌0.9%氯化钠溶液)，模型组(按150mg·kg-1·d-1灌腺嘌呤混悬液)，黄葵胶囊组(按0.75mg·kg-1·d-1灌胃给药)，圆柚酮高剂量组(按20mg·kg-1·d-1灌胃给药)，圆柚酮中剂量组 (按10mg·kg-1·d-1灌胃给药)，圆柚酮低剂量组 (按5mg·kg-1·d-1灌胃给药)，各组每日灌胃1次，不限制饮食和水，干预周期为2周，期间不使用抗CKD药物。

2.3检测指标

2.3.1尿蛋白2周末，分别将各组大鼠置于代谢笼内，禁食不禁水，收集24h尿液，计24h尿量，充分混匀后1300r·min-1离心5min，收集上清液，通过尿蛋白定量试剂测定24h尿蛋白量。

2.3.2肾功能 大鼠空腹6h后，乙醚麻醉，腹主动脉取血，分离血清，通过尿素氮试剂盒和肌酐试剂盒分别检测血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、血清肌酐(serum Creatinine，SCr)。

参照文献采用HPLC荧光法测定血浆中硫酸吲哚酚(IS)的含量[8]：Phenomenex Luna色谱柱(150mm×4.6mm，5μm)，流动相：乙腈-水-三氟乙酸(15∶85∶0.2，V/V/V)；流速：1mL·min-1；柱温：30℃；激发波长：280nm，发射波长：390nm。以硫酸吲哚酚浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线(Y=3.348X-3097，r=0.9998)，对样品进行测定，见图2。

2.3.3病理切片 药物对腺嘌呤致肾损伤的肾组织学实验中病理切片委托南京医科大学病理教研室检测。观察指标包括：1)肾小球有无增生或萎缩；2)肾小管有无扩张、管型和尿酸盐沉积；3)间质有无炎细胞浸润、纤维组织增生等病变。

注：A.硫酸吲哚酚对照品；B.血浆样品。图2 硫酸吲哚酚HPLC图

2.4统计学处理

3 结果

3.1尿蛋白

表1结果显示，与正常组相比，模型组的24h尿蛋白定量给药后明显升高；与模型组相比，给药2周后各给药组则明显降低，其中圆柚酮高剂量组较低剂量组降低明显。

3.2肾功能

表2结果表明，与正常组相比，给药后各组小鼠的SCr、BUN、IS升高明显；与模型组相比，各给药组中圆柚酮低剂量组小鼠的IS略微升高，其他给药组小鼠的SCr、BUN、IS降低明显，其中高剂量组大鼠血清中BUN、IS降低较低剂量组明显，而低剂量组血清中SCr较高剂量组降低明显。

表1 不同剂量圆柚酮对CKD大鼠24 h尿蛋白的影响

注：与正常组比较，#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05；下同。

表2 不同剂量圆柚酮对CKD大鼠的BUN、Scr、IS影响

3.3病理切片

图3、表3结果表明,与正常组比，给药组大鼠肾小球轻微萎缩，肾小管扩张均增大，管型病变，尿酸沉积增高，肾间质中出现炎症及纤维增生；与模型组相比，给药组大鼠肾病均有不同程度减轻，圆柚酮高剂量组>圆柚酮中剂量组>黄葵胶囊组>圆柚酮低剂量组。

注：A.正常组；B.模型组；C.黄葵胶囊组；D.圆柚酮高剂量组；E.圆柚酮中剂量组；F.圆柚酮低剂量组。图3 不同剂量圆柚酮对腺嘌呤致CKD实验病理切片图(HE染色)

组别剂量/mg·kg-1病理结果得分正常组0.60±0.55模型组15011.20±0.45##黄葵胶囊组0.757.50±1.96**圆柚酮高剂量组205.20±0.76**圆柚酮中剂量组105.30±0.89**圆柚酮低剂量组55.50±1.27**

4 讨论

随着我国居民生活方式的转变，CKD的发病率不断提高，2012年流行病学调查显示[3]，CKD的患病率高达10.8%。目前CKD的诊断指标主要包括尿蛋白、血肌酐和血清尿素氮等，其中尿蛋白是慢性肾病诊断的重要依据，也是评定肾病治疗效果的重要指标之一，临床通常监测24 h尿蛋白定量来判断蛋白尿出的多少，来评判肾脏的功能。血肌酐(Cr)和尿素氮(BUN)是人体蛋白质新陈代谢的产物，当肾脏功能正常时，可将多余的Cr和BUN排出体外，使Cr和BUN在血液中保持着稳定，在肾功能受损时，导致Cr和BUN在血浆中积累，因而测定血Cr和BUN可以评价肾功能的损伤程度。IS是色氨酸的代谢产物，高浓度的IS在血浆中与蛋白结合后，不仅可以诱发尿毒症，同时还可以刺激肾组织产生TGF-β1、α-SMA、PDGF等纤维化因子，促进肾脏纤维化，导致慢性肾病的恶化，因此IS也是肾脏疾病监测的重要指标之一[9]。

由于CKD疾病复杂，发病机理不明确，目前CKD尚缺乏有效的治疗药物，临床多以控制指标为主，常用化学药包括激素、免疫抑制剂、ACEI/ARB等，临床常用中药有黄葵胶囊、百灵胶囊等，主要功效为解毒消肿、清利湿热、活血化瘀。其中黄葵胶囊具有抑制免疫反应、减轻炎症反应、改善肾纤维化、保护肾小管上皮细胞等多方面功效[10-11]，在临床上得到了广泛应用，本实验选择了黄葵胶囊作为阳性对照药。

益智具有暖肾固精缩尿、温脾止泻摄唾之功效，用于肾虚遗尿、小便频数、遗精白浊、脾寒泄泻、腹中冷痛、口多唾涎[12]。益智的化学成分多样，其中倍半萜类化合物为主要特征成分[13]。本文对倍半萜类成分的主要化合物圆柚酮进行了抗CKD的作用研究。研究发现，与模型组相比，圆柚酮高剂量组可以明显减少血液中尿素氮、肌酐、硫酸吲哚酚，增加尿量；通过病理切片可以看出圆柚酮高剂量组能够在一定程度上改善肾组织。结果显示圆柚酮具有较好的治疗慢性肾病的作用，多项指标优于临床常用药物黄葵胶囊，可以作为慢性肾病的候选药物。

[1] Stack A G，Casserly L F，Cronin C J，et al.Prevalence and variation of Chronic Kidney Disease in the Irish health system：initial findings from the National Kidney Disease Surveillance Programme[J].BMC Nephrol，2014，15：185.

[2] De Nicola L，Donfrancesco C，Minutolo R，et al.on behalf of the ANMCO-SIN Research Group.Prevalence and cardiovascular risk profile of chronic kidney disease in Italy：results of the 2008-12 National Health Examination Survey[J].Nephrol Dial Transplant，2015，30(5)：806-814.

[3] Zhang L，Wang F，Wang L，et al.Prevalence of chronic kidney disease in China：a cross-sectional survey[J].Lancet，2012，379 (9818)：815-822.

[4] 刘平夫.慢性肾炎蛋白尿的中医辨治[J].长春中医药大学学报，2013，29(3)：447.

[5] 汪庵.本草易读[M].北京：人民卫生出版社，1987：161.

[6] 汪昂.本草备要[M].北京：中国中医药出版社，2009：126.

[7] 缪希雍.神农本草经疏[M].北京：中医古籍出版社，2002：217.

[8] 吴淳，石成钢，李梅，等.HPLC-FLU 法测定人血清中硫酸吲哚酚浓度及其在血液透析病人中的应用[J].中国临床药理学与治疗学，2010，15(8)：906-910.

[9] 余彦霖，肖堂利，刘亮，等.硫酸吲哚酚促进肾纤维化的机制研究[J].第三军医大学学报，2016，38(2)：119-123.

[10]高渝.黄葵胶囊在肾移植术后蛋白尿中的应用[J].现代中西医结合杂志，2011，20(1)：49-51.

[11]陈萍，万毅刚，王朝俊，等.黄蜀葵花制剂治疗慢性肾脏病的机制和疗效[J].中国中药杂质，2012，37(15)：2252-2256.

[12]国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2015：291.

[13]张俊清，王勇，陈峰，等.益智的化学成分与药理作用研究进展[J].天然产物研究与开发，2013，25(2)：280-287.

StudyontheRenalProtectionofNootkatonefromAlpiniaeoxyphyllaeFructus

LIU Changhong1，LI Yonghui2*，LI Peipei2

(1.Laiyuan Hospital of Chinese Medicine，Laiyuan 074300，China；2.School of Pharmacy，Hainan Medical University，Haikou 571199，China)

Objective：The efficacy of nootkatone in treating chronic kidney disease were evaluated to explain the active constituents of Alpiniae oxyphyllae Fructus.Methods：Using a rat model of adenine-induced CKD，the protective effect of nootkatone on renal damage were studied，and 24 hours urine，urine protein (UP24h)，blood urea nitrogen (BUN)，serum creatinine (Scr) sulfuric acid indole alcohol (IS) were measured.And the kidney histopathology were also observed to determine nootkatone therapeutic effect of CKD.Results：Compared with the model group，nootkatone group each dose renal tissue biopsy morphology were improved，in which the high-dose group nootkatone > nootkatone middle dose group > Huang Kui capsule group > nootkatone middle dose group.And the IS，BUN and urine protein content the in high-dose group decreased significantly compared with middle dose group.Compared with high-dose group，serum Scr was significantly lower in middle dose group.Conclusion：The protective action of nootkatone on CKD showed a significant dose-effect relationship，the efficacy of the high-dose group is stronger than that of the middle-dose group.

Alpiniae oxyphyllae Fructus；nootkatone；Chronic Kidney Disease；renal protection；pathological section

国家自然科学基金项目(8156140281)

] 李永辉，博士，研究员，研究方向：中药药理学及活性成分研究；Tel：(0898)66895337，E-mail：lyhssl@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.8.019

2016-12-22)

*[