齐磊，罗琼枝，戴待，张媛

(北京中医药大学 中药学院，北京 100102)

·基础研究·

雪菊性状特征与质量相关性研究△

齐磊，罗琼枝，戴待，张媛*

(北京中医药大学 中药学院，北京100102)

目的：探究雪菊性状特征与质量的相关性，为中草药“辨状论质”理论提供论据，同时为雪菊药材标准的建立奠定基础。方法：通过研究不同批次雪菊药材的舌状花性状特征、HPLC图相似度及奥卡宁和马里苷两种主要查尔酮类成分的含量测定，以探寻性状特征与化学成分特征间的关系。结果：不同批次雪菊的舌状花，其红褐色部分所占比例及颜色深浅存在差异；其化学成分的HPLC图谱虽得到较高相似度，但样品中两种主要成分的含量存在明显差异，且其含量与样品性状特征密切相关。结论：雪菊的内在质量与舌状花的性状特征存在相关性。

雪菊；性状；含量测定；马里苷；相关性

雪菊为菊科金鸡菊属植物两色金鸡菊CoreopsistinctoriaNutt.的干燥头状花序，维吾尔语名为“古丽恰依”(Gulqai)。据《新疆植物志》记载，两色金鸡菊具有清热解毒、化湿止痢之功效[1]。两色金鸡菊的舌状花上半部黄色，下半部红褐色[2]，是其与同属近缘植物的主要区别。

雪菊中黄酮类成分含量很高[3-4]，并具有抗氧化[5-6]、抗衰老[7-8]、抗肿瘤[9-10]等药理活性。本课题组前期研究发现雪菊黄酮部位具有抑制小鼠前脂肪细胞3T3-L1的增殖分化作用[11]，是雪菊重要的活性部位，其中马里苷、奥卡宁两种查尔酮类成分是雪菊黄酮部位的主要成分，可以用来评价该部位的质量。

本实验收集10批雪菊药材商品，通过研究样品的舌状花性状特征、HPLC图相似度及马里苷与奥卡宁的含量，比较不同批次的雪菊药材间的质量差异，确定雪菊性状特征与内在质量的相关性，为建立雪菊药材质量标准提供理论依据。

1 仪器与试药

1.1仪器

岛津LC-20AD型高效液相分析色谱仪；MerckC-18分析型色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；KQ-500E型超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司，功率500W)；分析天平(MettlerToledo，万分之一，十万分之一)；高速万能粉碎机(北京中兴伟业仪器有限公司)；40目筛；5mL离心管；DragonLab1000μL移液枪；5mL、25mL容量瓶；解剖针；玻璃培养皿。

1.2软件

SAS9.4版(SASInstituteInc.，Cary，NC，USA)；中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.130723版，国家药典委员会)

1.3试药

乙腈(色谱纯，Sigma-Alrich)；甲醇、甲酸(分析纯，北京化工厂)；娃哈哈纯净水。马里苷对照品(自制，采用面积归一化法，纯度大于97.0%)；奥卡宁对照品(自制，采用面积归一化法，纯度大于99.0%)。

市购雪菊药材10批，编号为XJ-1～10，样品信息见表1，由北京中医药大学张媛副教授鉴定均为两色金鸡菊CoreopsistinctoriaNutt.的头状花序，其中XJ-3、XJ-6样品中出现同科植物的舌状花。

表1 雪菊药材样品信息

2 方法

2.1性状鉴别

2.1.1性状对比 选取不同批次样品中完整的舌状花，用水浸泡至完全展开，取出，平铺于培养皿中并展开。观察并对比各批次样品舌状花的颜色特征差异，进行量化评级。

2.1.2评价标准 红褐色部分大小按红褐色部分长度占舌状花总长度比值计：30%～35%者为“1”；35%～40%者为“2”；40%～50%者为“3”；≥50%者为“4”。颜色深浅按照肉眼所视，红褐色部分不明显甚至近无者为“Ⅰ”；边缘模糊，可以看到红褐色者为“Ⅱ”；边缘较模糊且呈明显红褐色者为“Ⅲ”；红褐色部分边缘清晰且有近黑色者为“Ⅳ”。样品中含有纯黄色舌状花的，仅按有红褐色部分舌状花的数据计算。

2.2HPLC图建立

2.2.1色谱条件 色谱柱：Merck C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：0.1%甲酸水(A相)，乙腈(B相)，流动相变化梯度(0～20min，16%～18%B；20～25min，18%～23%B；25～30min，23%～27%B；30～35min，27%～35%B；35～40min，35%～68%B；40～45min，68%～95%B)；流速：1.2mL·min-1；柱温：40℃；检测波长：280nm；进样量：5μL。

2.2.2供试品溶液制备 精密称取过40目筛的雪菊药材粉末0.100g，置5mL离心管中，加入2mL70%甲醇，超声提取30min，过滤，滤液转移至25mL容量瓶中，加70%甲醇定容，得供试品溶液。

2.2.3精密度考察 取同一样品溶液(编号XJ-5)，按2.2.1项下色谱条件，连续进样6次，对各色谱图相似度进行评价。结果显示各图谱间相似度≥99%，表明仪器精密度良好。

2.2.4稳定性考察 取同一样品溶液(编号XJ-5)，按2.2.1项下色谱条件，分别在0、2、4.5、9.5、12、36、48h时进样测定，对各色谱图相似度进行评价。结果显示各图谱间相似度≥98%，表明样品在48h内稳定。

2.2.5重复性考察 取同一样品6次(编号XJ-5)，按2.2.2项下方法制得供试品溶液6份，分别按2.2.1项下色谱方法进样检测，对各色谱图相似度进行评价。结果显示各图谱间相似度≥99%，表明该方法重复性良好。

2.2.6样品检测及相似度评价 使用2.2.1项下色谱方法对各样品进行检测，得到HPLC图。使用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版对得到的10批样品的HPLC图进行相似度评价。

2.3含量测定

2.3.1色谱条件 检测波长为380nm，其他条件与2.2.1项下相同。

2.3.2对照品溶液制备 精密称取马里苷与奥卡宁对照品各5.0mg，分别置于2个5mL容量瓶中，加70%甲醇溶解并稀释至刻度，定容，制成浓度为1.0mg·mL-1对照品储备溶液，备用。

2.3.3供试品溶液制备 同2.2.2项下方法。

2.3.4线性关系考察 分别精密吸取适量的两种对照品储备溶液，置5mL容量瓶中，加入70%甲醇稀释至刻度，定容，制成马里苷质量浓度为0.8、0.6、0.4、0.2、0.1mg·mL-1，奥卡宁质量浓度为0.04、0.03、0.02、0.01、0.005mg·mL-1的混合对照品溶液，按2.1项下色谱方法进样分析，以对照品质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线并计算回归方程。结果马里苷含量标准曲线回归方程为Y=6 595.96X+43.81，r=0.999 0；奥卡宁含量标准曲线回归方程为Y=23 123.05X+5.08，r=0.999 9。说明马里苷在进样量0.5～4 μg、奥卡宁在进样量0.025～0.2 μg与峰面积呈良好的线性关系。

2.3.5 精密度考察 取同一样品溶液(编号XJ-5)，按2.3.1项下色谱条件，连续进样6次，分别记录马里苷与奥卡宁色谱峰峰面积，计算RSD。结果马里苷峰面积RSD=0.93%、奥卡宁峰面积RSD=1.01%，表明仪器精密度良好。

2.3.6 稳定性考察 取同一样品溶液(编号XJ-5)，按2.3.1项下色谱条件，分别在0、2、4.5、9.5、12、36、48 h时进样测定，计算马里苷与奥卡宁峰面积RSD值。结果马里苷峰面积RSD=0.84%、奥卡宁峰面积RSD=0.94%，表明样品在48 h内稳定。

2.3.7 重复性考察 取同一样品6次(编号XJ-5)，按2.3.3项下方法制得供试品溶液6份，分别按2.3.1项下色谱方法进样检测，计算马里苷与奥卡宁色峰面积RSD值。结果马里苷峰面积RSD=1.22%、奥卡宁峰面积RSD=1.99%，表明该方法重复性良好。

2.3.8 加样回收率试验 称取已知化合物含量的同一样品9份(编号XJ-05，马里苷含量为62.50 mg·g-1，奥卡宁含量为3.37 mg·g-1)，平均分成高、中、低3个剂量组，分别加入适量的对照品后，按2.3项下方法制得样品溶液，分别按2.3.1项下色谱方法检测，计算回收率，结果见表2。

表2 雪菊中马里苷、奥卡宁加样回收率试验

2.3.9 样品测定 分别称取10批雪菊药材适量，按2.2.2项下方法制成样品溶液，按2.3.1项下方法分别检测并计算，得到各批次样品马里苷与奥卡宁的含量。

2.4聚类分析

将舌状花性状特征、HPLC图相似度及两种化合物在药材中的含量作为变量，使用SAS9.4软件进行聚类分析分组，通过对各组内样品的舌状花性状特征与含量的特点共性分析，探索雪菊舌状花性状与内在成分的相关性。

3 结果

3.1性状特征

通过测量，10批样品的舌状花长度均在8～16mm。通过对比发现，不同批次雪菊样品的舌状花的红褐色部分所占比例及颜色存在差别。

各批次样品性状对照见图1，评价结果见表3。

红褐色部分平均比例(%)红褐色部分大小评级红褐色部分颜色评级XJ-148.43ⅠXJ-265.54ⅣXJ-361.54ⅢXJ-456.74ⅡXJ-549.23ⅡXJ-635.72ⅣXJ-731.11ⅡXJ-845.23ⅡXJ-935.42ⅡXJ-1052.84Ⅳ

3.2HPLC图相似度评价结果

通过使用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对10批样品的HPLC图进行相似度评价，发现各样品间HPLC图相似度均≥0.950，说明各样品间的成分差异较小。各样品的HPLC图见图2，相似度对比见表4。

图2 雪菊药材HPLC图相似度评价图

表4 雪菊药材HPLC图相似度评价表

3.3含量测定结果

使用标准曲线法对马里苷与奥卡宁两种化合物进行检测并计算，最终得到各批次样品中两种化合物的含量。样品与对照品HPLC图见图3，含量测定结果见表5。

注：1.马里苷；2.奥卡宁。图3 雪菊样品及对照品HPLC图

编号马里苷奥卡宁峰面积质量分数/mg·g-1峰面积质量分数/mg·g-1XJ-11788.54666.13312.4943.32XJ-23329.843124.55194.4342.05XJ-32054.59476.23268.3792.85XJ-42299.08785.48248.1272.63XJ-52090.01177.55260.2772.76XJ-61693.08762.50316.6713.37XJ-71632.84660.23214.9342.27XJ-82517.15993.75190.9312.01XJ-91891.06170.02188.6691.99XJ-103030.050113.18168.5011.77

3.4聚类分析结果

因HPLC图谱相似度评价结果为无差异，故聚类分析的变量设置为舌状花红褐色部分的大小、颜色深浅及马里苷与奥卡宁的含量。使用SAS9.4软件进行分析。结果XJ-2、XJ-10为第一组；XJ-3、XJ-6为第二组；XJ-7、XJ-9为第三组；XJ-1、XJ-4、XJ-5、XJ-8为第四组。聚类分析树状图见图4。

图4 雪菊样品的聚类分析树状图

3.5结论

10批雪菊药材的HPLC图谱相似度均≥0.950，不同批次雪菊所含化学成分的种类具有很高的相似性。但经含量测定发现，10批样品的马里苷与奥卡宁质量分数分别在60.23～124.55、1.77～3.32mg·g-1，差异较大。通过聚类分析，本实验将10批药材分成4组。其中第一组样品的马里苷含量均大于110mg·g-1，红褐色部分颜色评级为“Ⅳ”且占比达到50%以上；组内XJ-2的红褐色部分比例大于XJ-10，马里苷含量XJ-2亦高于XJ-10。第二组的样品中均发现纯黄色舌状花，含量测定结果显示该组两个样品的马里苷含量较低，分别为76.23、62.50mg·g-1。第三组样品红色部分面积均在40%以下且颜色评级为“Ⅰ”～“Ⅱ”，马里苷含量较低，分别为60.23、70.02mg·g-1以下。第四组样品的红褐色部分所占比例均在45%以上，颜色评级除XJ-1为“Ⅰ”，其他样品均为“Ⅱ”；马里苷含量以XJ-1的66.13mg·g-1最低，其他3个样品中马里苷质量分数分别为77.55、85.48、93.75mg·g-1。综上所述可以发现，雪菊药材的舌状花的红褐色部分比例越大，颜色越深，马里苷含量越高，反之则马里苷含量越低；纯黄色舌状花的出现会降低样品中马里苷含量。这说明雪菊舌状花红褐色部分的大小、颜色深浅与马里苷含量间存在正相关，可通过雪菊舌状花的性状特征初步判断雪菊中的马里苷含量的高低。

4 讨论

4.1马里苷作为指标成分的探讨

由本实验可知，马里苷是雪菊中的主要成分之一，含量较高，有研究表明马里苷具有良好的降脂[11-12]、抗氧化活性[13]，可以作为雪菊质量评价的指标成分。

4.2纯黄色舌状花对雪菊药材质量的影响

据《中国植物志》记载，雪菊舌状花下部为红褐色[2]，约占舌状花的1/3，可以作为雪菊真伪鉴别的重要特征。本实验收集的部分样品中出现纯黄色舌状花，与雪菊性状特征不符，且马里苷含量均较低，说明黄色舌状花的存在直接影响样品的质量，至于所掺入的黄色舌状花的来源有待进一步的研究。

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StudyonCorrelationbetweenMacroscopicPropertiesandQualitiesofHeadInflorescencesofCoreopsistinctoria

QI Lei，LUO Qiongzhi，DAI Dai，ZHANG Yuan*

(Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China)

Objective：To study the qualities of the head inflorescences ofCoreopsistinctoriaand find the correlation between macroscopic properties and qualities to demonstrate the theories of “assessing the quality by distinguishing features of traditional Chinese medicinal materials”.Methods：The macroscopic properties of head inflorescences and the similarity of HPLC chromatograms of different batchesC.tinctoriawere examined，and contents of marein and okanin were determined.Results：There existed differences in proportion and color depth of different batches of “samples’ ligulate” flowers reddish-brown part，the similarity of HPLC chromatograms was high，but contents of marein and okanin were significantly different. The proportion and color of reddish-brown part of ligulate flower were related to the contents of marein and okanin significantly.Conclusion：The quality of the head inflorescences ofC.tinctoriais directly related to the character of the ligulate flower.

The head inflorescences ofCoreopsistinctoria;feature;determination of content; marein; correlation

国家自然科学基金青年科学基金项目(81202999)

] 张媛，副教授，研究方向：中药与民族药药效物质基础及质量标准；E-mail：zhy0723@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.8.015

2017-03-26)

*[