胡梦，王瑞生，文雯，刘英，胡海峰*

(1.上海医药工业研究院，上海 201203；2.国药集团健康产业研究院有限公司，上海 201203；3.河南中医药大学，河南 郑州 450008)

·基础研究·

百药煎传统炮制过程中微生物的分离与初步鉴定及其鞣质水解能力测定△

胡梦1，2，王瑞生3，文雯1，2，刘英1，2，胡海峰1，2*

(1.上海医药工业研究院，上海 201203；2.国药集团健康产业研究院有限公司，上海 201203；3.河南中医药大学，河南 郑州 450008)

目的：揭示百药煎传统炮制过程中的微生物菌群，同时初步考察所分离菌株鞣质水解能力。方法：应用经典微生物分离纯化方法，结合形态学考察和16S rDNA 或18S rDNA基因序列分析，对百药煎炮制过程中样品进行微生物的分离及菌种初步分类鉴定。采用含单宁酸的固体培养基初步筛选具有鞣质降解能力的菌株。结果：共分离获得细菌7株、酵母菌7株、丝状真菌3株。7种细菌分别为枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、地衣形芽孢杆菌 、黄海芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌菌株、同温层芽孢杆菌、其他芽孢杆菌；7种酵母菌分别为伯顿丝孢毕赤酵母、2株克鲁维酵母菌株、弗比恩酵母菌、奥默柯达菌、异常威克汉姆酵母菌、异常毕赤酵母菌；3株丝状真菌分别为青霉菌、卷枝毛霉菌、黑曲霉菌。除枯草芽孢杆菌、黄海芽孢杆菌、芽孢杆菌、克鲁维酵母菌HMY3、弗比恩酵母菌外，其余菌株均具有鞣质降解能力。结论：百药煎传统发酵炮制工艺涉及多种微生物共同参与混合发酵过程，初步筛选证明5株细菌、5株酵母菌和3株丝状真菌具有鞣质降解能力，这一发现为研究百药煎现代炮制工艺奠定了微生物菌种基础。

百药煎；炮制；微生物；分离；鉴定

百药煎是由五倍子、茶叶和酒糟等经自然发酵而制成的传统中药饮片，始载于《丹溪心法》[1]。百药煎成品为布满白霜的块状物，味酸甘，性平，具有润肺化痰、止血止泻、解热生津等功效，主治肺虚久咳、久泻久痢、便血痔血、痈肿疮毒、皮肤湿烂等症[2]。百药煎的主要原料为五倍子，五倍子中含有大量鞣质类成分及少量没食子酸，2015年版《中华人民共和国药典》规定五倍子鞣质含量不少于 50%，五倍子中鞣质含量甚至高达70%以上[3]。有报道认为鞣质具有肝毒性，而发酵转化生成的没食子酸具有抗肿瘤、杀锥虫、抗炎、抑菌、抗病毒、降糖降酯等作用，五倍子发酵成为百药煎过程中鞣质在单宁酶作用下水解生成没食子酸，是其功效发生改变的物质基础。百药煎传统炮制法是利用自然界多菌种混合固体发酵而成，多为霉菌和细菌。由于自然发酵菌种不纯，针对性不强，参与发酵的菌种和数目都存在一定的波动，且百药煎固体发酵过程中鞣质和没食子酸基质浓度不易调控，添加物质难以混合均匀，整个炮制过程凭主观经验来控制[4]，使得百药煎的量化生产受到限制。本实验采用经典微生物学分离方法分离并初步鉴定百药煎炮制品中微生物，考察所分离菌株原料耐受性及鞣质水解特性，为实现百药煎现代炮制工艺化生产奠定菌种基础。

1 材料与仪器

1.1材料

1.1.1样品 百药煎传统炮制品 (四川辅正药业股份有限公司)；经河南中医药大学张振凌教授鉴定为正品；五倍子(安徽亳州沪谯中药饮片公司，批 号：20160824)；绿茶(中国农业科学院茶叶专业市场)；酒糟(镇江酒厂)。

1.1.2样品制备 取绿茶加20倍体积蒸馏水溶解，煎煮，过滤，弃去残渣，得茶汁。五倍子细粉-酒糟细粉(1∶4)混合均匀，加入适量茶汁搅拌，以握之成团，捏之即碎为度。将混合物放置于托盘，透明塑料膜遮盖，置于阴凉通风处，自然状态发酵，待表面长满一层白色菌毛，即停止发酵，将百药煎切块烘干，即得。分别在发酵时间为0、6、18、24、30、42、48、66h取样，样品编号分别为C1～C8。

1.1.3其他试剂 LB培养基、MRS培养基、PDA培养基、高氏一号培养基、马丁培养基 (国药集团化学试剂有限公司)；单宁酸(国药化学试剂有限公司)；Fx KOD Buffer、 TES(Tris-HCl pH7.510mmol·L-1、EDTA1mmol·L-1、NaCl50mmol·L-1)、脱氧核糖核苷三磷酸 、dNTP、Fx KOD 酶、Easy Taq Buffer、Easy Taq 酶(TaKaRa公司)；引物NS1、NS2(南京金斯瑞生物科技有限公司合成)。

1.2仪器

电子天平(上海精科天平)；精密数显示酸度计(Sartorius)；压力蒸气灭菌锅(上海华线医用核子仪器有限公司)；超净工作台(上海智城分析仪器制造有限公司)；生化培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)；恒温培养振荡器(上海智城分析仪器制造有限公司)；PCR扩增仪(德国Eppendorf公司)。

2 方法

2.1分离及纯化培养基

2.1.1LB培养基 添加过滤除菌甲醇溶制霉菌素，终质量浓度为50μg·mL-1，乳酸菌外细菌分离培养用。

2.1.2MRS培养基 添加终质量浓度为100μg·mL-1溴甲酚绿指示剂，高压蒸气灭菌乳酸菌产酸使显色剂变黄，乳酸菌分离培养用。

2.1.3PDA培养基 添加过滤除菌、终质量浓度为50μg·mL-1硫酸链霉素，真菌分离培养用。

2.1.4高氏一号培养基 添加过滤除菌、终质量浓度为100μg·mL-1重铬酸钾，放线菌分离用。

2.2微生物的分离与纯化

2.2.1样品处理

2.2.1.1样品稀释 取样品5g，在无菌条件下加至装有45mL无菌0.9%氯化钠溶液、含玻璃小珠的250mL锥形瓶中，振摇约30min，使菌分散，得稀释10倍菌悬液，采用10倍梯度稀释，得0.9%氯化钠溶液稀释后菌悬液。

2.2.1.2样品增菌培养 取样品约1g，无菌条件下分别加入2.1分离培养基中，LB液体培养基于37 ℃、200 r·min-1振荡培养1.5 d，MRS液体培养基于37 ℃静置培养1.5 d，PDA液体培养基于28 ℃、200 r·min-1振荡培养2.5 d。增菌后培养液采用10倍梯度稀释，得富集培养后稀释菌液。

2.2.2 微生物分离 分别吸取0.2 mL样品不同稀释度的菌悬液，均匀涂布于LB固体平板、MRS固体平板以及PDA固体平板表面，其中将LB培养基、MRS培养基倒置于37 ℃恒温培养箱中培养；将PDA培养基、高氏一号培养基倒置于28 ℃培养箱中培养。

2.2.3 菌株纯化 将各培养基表面长出的菌落进行平板划线，直至菌株菌落形态一致。

2.3菌株初步鉴定

2.3.1形态学观察

2.3.1.1菌落形态 用接种针取单菌落，细菌接种于LB培养基，置37℃恒温培养箱中培养；真菌接种于PDA培养基，置28℃恒温培养箱中培养，观察菌体在培养基中的菌落形态与生长情况。

2.3.1.2显微形态 细菌用结晶紫染色，置于显微镜下观察细菌结构，同时进行革兰氏染色；酵母菌用美蓝染色，置于显微镜下观察；丝状真菌用插片法进行培养，待菌丝长过插片的位置后，取出玻片进行显微镜观察。

2.3.216S rDNA/18S rDNA分子生物学鉴定

2.3.2.116SrDNA分子生物学鉴定 细菌菌落PCR：以菌落为模板，上游引物27F：5′ GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG3′，下游引物1495R：5′CTACGGCTACCTTGTTACGA3′，完成PCR扩增。PCR体系为 Fx KOD Buffer10μL dNTP0.4μL引物各0.4μL、Fx KOD酶0.4μL、DMSO1μL、ddH2O10μL。PCR程序为95℃预热5min，94℃变性30s，56℃退火35s，72℃延伸90s，循环30次，72℃保持10min，16℃保温。用1%琼脂糖凝胶电泳对PCR结果进行验证，将扩增产物进行测序并对结果进行序列分析。

2.3.2.218S rDNA分子生物学鉴定 真菌以提取的基因组DNA为模板，上游引物NS1：5′GTAGTCATATGCTTGTCTC3′，下游引物NS2：5′GGCTGCTGGCACCAGACTTGC3′，完成 PCR扩增。基因组提取：取培养的真菌一管，装入细砂，用FastPrep 仪器进行操作(5m·s-1，10s，2次)。然后加入500μL DES 溶液和5μLβ-巯基乙醇，混匀，65℃水浴30min。加入500μL水饱和苯酚-三氯甲烷-异戊醇(25∶24∶1)，12000r·min-1离心5min。将上清液转移至1.5mL离心管中，再加500μL水饱和苯酚-三氯甲烷-异戊醇(25∶24∶1)，沉淀1次。12000r·min-1离心5min后，将上清液转移至1.5mL离心管中，加入冷的70%乙醇混匀，-20℃沉淀2h。12000r·min-1离心5min，挥干残余的乙醇，加入TER溶液溶解。PCR体系为Easy Taq Buffer10μL、dNTP0.4μL、引物各0.4μL、Easy Taq酶0.4μL、DMSO1μL、模板0.2μL、ddH2O8μL。PCR程序：98℃预热5min，96℃变性20s，52℃退火90s，72℃延伸90s循环30次，72℃保持10min，16℃保温。用1%琼脂糖凝胶电泳对 PCR结果进行验证，将扩增产物进行测序并对结果进行序列分析。

2.3.2.3测序 选取扩增结果阳性的产物进行测序，将PCR测序结果提交至美国国立生物技术信息中心(NCBI)，与Gene Bank数据库中已知基因序列进行Blast对比分析待测菌株与模式菌株的同源性。

2.4菌株鞣质降解能力分析

鞣质能与蛋白质形成白色不溶性沉淀，鞣质水解后生成的没食子酸呈酸性，能使含溴甲酚绿指示剂的培养基由绿色变为黄色，通过观察筛选固体培养基上是否形成透明圈或者培养基颜色的变化，初步判断所分离菌株的鞣质水解能力。

2.4.1真菌降解鞣质能力 在马丁固体培养基表面，滴加含1%鞣质、0.004%溴甲酚绿溶液1mL，于固体平板表面形成淡黄色不透明层，吸去多余液体，接种针点接酵母菌及丝状真菌，于30℃倒置培养4d，观察菌株周围是否有水解透明圈出现及培养基表面颜色变化[5]。

2.4.2细菌降解鞣质能力 在无菌条件下于LB固体培养基表面滴加1mL0.2%鞣质，表面形成白色不溶沉淀，点接细菌后，于37℃培养4d，观察菌落周围有无变色圈或水解透明圈。

3 结果与分析

通过对百药煎炮制过程中不同时间点的样品进行分离，总共得到细菌7种，酵母菌7种，丝状真菌3种，结合形态学和分子生物学对所分菌株进行综合鉴定。

3.1细菌

3.1.1细菌形态观察 所分离的细菌采用HMB结合阿拉伯数字大小依次编号，各株细菌在LB平板上的菌落形态、细胞形态及革兰染色结果见表1。

3.1.2细菌种属初步鉴定 将 PCR 测序结果提交至NCBI，与Gene Bank 数据库中已知基因序列进行Blast 对比，分析待测菌株与模式菌株的同源性。根据细菌菌株的16S rDNA序列比对分析结果及其形态学特征，并结合《细菌鉴定手册》和《微生物分类学》等有关资料，对所分细菌进行初步鉴定，见表2。

表1 百药煎炮制品中所分离细菌的形态特征

表2 百药煎炮制品中所分离细菌种属初步鉴定结果

3.2真菌

3.2.1酵母菌形态学特征 所分离的酵母菌采用HMY结合阿拉伯数字按大小依次编号，各酵母菌在PDA平板上的菌落形态及显微观察情况见表3。

表3 百药煎炮制品中所分离酵母菌的形态特征

3.2.2 酵母菌的初步鉴定 根据真菌菌株的18S rDNA序列同源性比对分析结果及其形态学特征，并结合《真菌鉴定手册》和《微生物分类学》等有关资料，对所分离酵母菌进行初步鉴定，鉴定结果见表4。

表4 百药煎炮制品中所分离酵母菌菌属初步鉴定

3.2.3 丝状真菌形态学特征 所分离的丝状真菌采用HMF结合阿拉伯数字按大小依次编号，各丝状真菌在PDA平板上的菌落形态及插片镜检结果见表5。

表5 百药煎炮制品中所分离丝状真菌的形态特征

注：A.HMF-1；B.HMF-2；C.HMF-3。图1 丝状真菌显微形态图

根据真菌菌株的18S rDNA序列同源性比对分析结果及其形态学特征，并结合《真菌鉴定手册》和《微生物分类学》等有关资料，对所分丝状真菌进行初步鉴定，鉴定结果见表6。

表6 百药煎炮制品中所分离丝状真菌的初步鉴定

3.3炮制过程中微生物菌群变化

3.3.1细菌菌数变化 以稀释涂布分离平板上菌落数在30～300个为宜，对百药煎样品C1～C8中的细菌计数，其变化规律见图2。

图2 百药煎炮制过程中细菌菌数变化规律

由图2可见，在百药煎炮制过程中菌株HMB1、HMB3、HMB7菌数变化规律相同，在样品C1～C5中菌数变化不大，在样品C6中菌数开始增加，并在样品C7、C8中菌数急剧增多。

3.3.2酵母菌菌数变化 以稀释涂布分离平板上菌落数在30～300个为宜，对百药煎样品C1～C8中的酵母菌计数，其变化规律见图3。

图3 百药煎炮制过程中酵母菌菌数变化规律

由图3可知，菌株HMY1在百药煎炮制过程中其菌数表现为先不变后增加再减少，在样品C5中其菌数达到最大；菌株HMY2在百药煎炮制过程中其菌数表现为先不变后逐渐增多的趋势，在样品C5中其菌数开始大幅度增多。

3.3.3丝状真菌菌数变化 以稀释涂布分离平板上菌落数在30～300个为宜，对百药煎样品C1～C8中的丝状真菌计数，其变化规律见图4。

图4 百药煎炮制过程中丝状真菌菌数变化规律

由图4可知，菌株HMF1在百药煎炮制过程中其菌数表现为先不变后增加的趋势，在样品C5中菌数开始增加；菌株HMF2在百药煎炮制过程中其菌数表现为先不变后减少为零的趋势；菌株HMF3在百药煎炮制过程中其菌数表现为增加后减少再维持不变的趋势，在样品C4中菌数达到最大。

3.4鞣质降解菌的筛选

筛选平板培养基中添加有单宁酸和溴酚蓝指示剂，如果菌株产单宁酶就会水解培养基中的单宁酸产生没食子酸，使菌落周围的溴酚蓝指示剂由蓝紫色变为黄色，从而在菌落周围形成明显的变色圈。根据产生变色圈的颜色深浅或菌落周围透明圈的大小共筛选出5株细菌(枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、地衣形芽孢杆菌 、巨大芽孢杆菌、同温层芽孢杆菌)，5株酵母菌(伯顿丝孢毕赤酵母、克鲁维酵母菌株、奥默柯达酵母菌、异常威克汉姆酵母菌、异常毕赤酵母菌)；3株丝状真菌(青霉菌、黑曲霉、卷枝毛霉菌)均具有降解鞣质能力。

4 结论与讨论

以传统百药煎炮制品为研究对象，从不同炮制阶段样品中共分离得到7种细菌、7种酵母菌、3种丝状真菌，并结合微生物菌落形态特征、显微形态及16S rDNA/18S rDNA分子序列比对对其进行初步鉴定。剔除同种菌株后，样品中所分离到微生物中，细菌包括枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、地衣形芽孢杆菌、芽孢杆菌属菌、巨大芽孢杆菌菌株、同温层芽孢杆菌、芽孢杆菌属菌；酵母菌包括伯顿丝孢毕赤酵母、克鲁维酵母菌株、克鲁维酵母菌株、弗比恩酵母菌、奥默柯达菌、异常威克汉姆酵母菌、异常毕赤酵母菌；丝状真菌包括青霉菌属真菌、卷枝毛霉菌、黑曲霉菌属真菌。样品中所分离到的细菌均具有产蛋白酶活性。

本实验采用含有单宁酸的固体平板初步筛选具产单宁酶特性的菌株。分离得到的5株细菌(枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、地衣形芽孢杆菌 、巨大芽孢杆菌、同温层芽孢杆菌)，5株酵母菌(伯顿丝孢毕赤酵母、克鲁维酵母菌株、奥默柯达酵母菌、异常威克汉姆酵母菌、异常毕赤酵母菌)；3株丝状真菌(青霉菌、黑曲霉、卷枝毛霉菌)均有鞣质降解特性。目前关于真菌类的曲霉属、青霉属菌株产单宁酶的研究报道较多，而细菌和酵母菌的相关报道较少[6-7]。与霉菌相比，细菌和酵母菌具有细胞结构简单、易于改造、生长繁殖快、适应能力强等优势，应用细菌及酵母菌的鞣质水解工艺研究更加方便，可进一步考察初筛得到的菌株降解鞣质能力的强弱。利用微生物发酵五倍子能有效避免鞣质在胃肠道内的竞争性消耗，有效地减少了大分子沉淀物的形成对胃黏膜的刺激。本研究不仅为实现百药煎的现代炮制工艺提供了菌种基础，通过初筛得到的具单宁降解特性的4株细菌和5株酵母菌株，也为细菌和酵母菌产单宁酶的研究提供了一定的参考。

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IdentificationandIsolationofMicroorganismsfromChineseGallLeavenSamplesduringItsProcessing

HU Meng1，2，WANG Ruisheng3，WEN Wen1，2，LIU Ying1，2，HU Haifeng1，2 *

(1.Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry，Shanghai 201203，China；2.Sinopharm Health Industry Institute Co.，Ltd.，Shanghai 201203，China；3.Henan University of Chinese Medicine，Zhengzhou 450008，China)

Objective：To reveal the beneficial microorganisms in processedChinesegallleavenduring their processing by traditional fermentation methods.Methods：Using classical microbial isolation and purification methods，the strains in processedChinesegallleavensamples were isolated and purified.The preliminary taxonomy of the strains isolated was carried out by investigating the morphological properties，and analyzing and comparing their 16S rDNA or 18S rDNA gene sequences.The ability of degradating tannic acid was determined.Results：Seven species of bacteria，seven species of yeasts and three species of filamentous fungi were isolated and identified in processedChinesegallleavensamples.The bacteria includeBacillussubtilis，Bacilluscereus，Bacilluslcheniformis，Bacillus，marisflavi，Bacillusmegaterium，Bacillusstratosphericus，andPaenibacillussp.，the yeasts wereHyphopichiaburtonii，Kluyveromycesmarxianus，Kluyveromycesmarxianus，Cyberlindnerafabianii，Kodamaeaohmeri，Wickerhamomycesanomalus，andPichiaanomala，and the fungi areAspergillusniger，Mucorcircinelloides，Penicilliumspp.By determining the ability of degradating tannic acid，other strains all showed to be positive except forBacillussubtilis，Bacillusmarisflavi，Paenibacillussp.，KluyveromycesmarxianusHMY3，Cyberlindnerafabianii.Conclusion：Many species of microorganisms exist in processedChinesegallleavensamples during its processing，in which five species of bacteria，five species of yeasts and three species of filamentous fungi are able to degrade tannic acid，which help to reconstruct modern fermentation technology of processedChinesegallleaven.

ProcessedChinesegallleaven；fermentation；microorganism；isolation；identification

国家中医药管理局中医药行业专项 (201507004)

] 胡海峰，研究员，研究方向：微生物药物研究与开发；Tel：(021) 62892873，E-mail：haifenghu88@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.8.014

2016-11-07)

*[