顾小辉，王国全，周亚奎，杨云，刘洋洋，刘培卫，冯剑，高志晖*，魏建和，*

(1.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所(中草药物质基础与资源利用教育部重点实验室，濒危药材繁育国家工程实验室)，北京 100193；2.广西大学 农学院，广西 南宁 530004；3.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所海南分所(海南省南药资源保护与开发重点实验室，国家中医药管理局沉香可持续利用重点研究室)，海南 海口 570311；4.贵州农业职业学院，贵州 贵阳 551400)

·专题·

虫漏沉香的基本特征及其品质评价△

顾小辉1，2，4，王国全2，周亚奎3，杨云3，刘洋洋3，刘培卫3，冯剑3，高志晖1*，魏建和1，3*

(1.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所(中草药物质基础与资源利用教育部重点实验室，濒危药材繁育国家工程实验室)，北京100193；2.广西大学 农学院，广西 南宁530004；3.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所海南分所(海南省南药资源保护与开发重点实验室，国家中医药管理局沉香可持续利用重点研究室)，海南 海口570311；4.贵州农业职业学院，贵州 贵阳551400)

目的：明确虫漏沉香的基本特征和品质特征。方法：调查野外虫蛀产生的虫漏沉香，并用分子方法鉴定虫源；收集市场上典型的虫漏沉香，进行感官特征、显微特征、醇浸物含量、沉香四醇含量及挥发油成分的测定和分析。结果：野外采集的虫漏沉香虫源鉴定出天牛科Cerambycidae眼花天牛属Acmaeops和木蠹蛾科Cossidae豹蠹蛾属Zeuzera的昆虫；市售虫漏沉香具有独特虫道特征，易于辨认，有明显的甘甜和清凉香味，木间韧皮部和木射线填充油脂；醇浸物含量相对较高，最高达38.35%，但沉香四醇含量相对较低，且不与醇浸出物呈正向关系；相对通体香和板头香，虫漏沉香具有G-cadinene、Guaia-3，9-diene或Costunolide等独特挥发油成分，但不同虫漏沉香之间挥发性成分种类差异较大。结论：本文首次报道了虫漏沉香可由天牛、木蠹蛾、白蚁等昆虫伤害形成，鉴定了二类可产生虫漏沉香的蛀干昆虫；首次报道虫漏沉香具有的感官特征、显微特征和化学成分特征，明确了虫漏沉香化学成分有其独特性。

沉香；虫漏沉香；虫源；感官特征；品质评价

沉香是瑞香科(Thymelaeaceae)沉香属(Aquilaria)植物中含有树脂的木材，是我国、日本、印度及东南亚等国家的传统名贵药材和天然香料[1]。国产沉香主要来源于白木香A.sinensis( Lour.) Gilg，为《中华人民共和国药典》法定来源物种[2]。健康的白木香树只有受到虫蛀、物理或化学伤害以及微生物侵染等，才会产生沉香[1]。其中由昆虫蛀蚀而产生的一类沉香习称为虫漏(又称蛊漏)，可称之为虫漏沉香。虫漏沉香在古文献记载中有所涉及，如《本草纲目》记载：“(沉香)其品凡四：曰熟结，乃膏脉凝结自朽出者；曰生结，乃刀斧伐仆，膏脉结聚者；曰脱落，乃因水朽而结者；曰虫漏，乃因蠹隙而结者”[3]。宋朝蔡绦在《铁围山丛谈》中记载：“谓之蛊漏，因伤蛊而后膏脉亦聚焉，故言蛊漏也”[4]。清代纳兰常安在《宦游笔记》中也有关于虫漏的记载：“香木枝柯窍露，大蚁穴其窍，蚁食石蜜，归而遗香其中，岁久渐渍，木受蜜气，结而坚润，则香成矣”[5]。虫漏沉香是中国沉香市场上颇受欢迎的一类野生沉香。前人对天然沉香的化学成分、结香机理、质量鉴定等开展了较多研究[1，6，7]，但虫漏沉香的科学研究很少，仅见Kalita等报道木蠹蛾科昆虫Zeuzeraconferta可以危害马来沉香A.malaccensis，并引起其结香[8]。虫漏沉香的结香比较特殊，为科学认识和利用虫漏沉香，本文首次报道了虫漏沉香的基本特征及其品质评价结果。

1 材料与方法

1.1植物材料

田间调查的白木香树林有二处。一处位于海南省海口市美兰区演丰镇海拔35m的沿海陆地，为移植于野外的白木香林，生长年限不等，但均在20年以上，也有部分种植年限十余年的白木香林。另一处位于广东省化州市平定镇海拔约200m的山地，为十多年生的白木香林，从受昆虫危害、产生了具有虫漏沉香特征的树木上收集昆虫，用于昆虫种类鉴定。

从市场上采集具有典型虫漏沉香特征的样品，用于品质特征研究(见表1)。其中通体结香技术产的沉香简称通体香[9，10]，全断干法产的沉香简称板头香[9]。经中国医学科学院药用植物研究所魏建和研究员鉴定，均来自白木香(A.sinensis)，保存于中国医学科学院药用植物研究所海南分所标本馆。

表1 用于品质特征研究的虫漏沉香及对照沉香

注：产地信息由商家提供。

1.2方法

1.2.1仪器和试剂 仪器主要有：ECLIPSE80i 显微镜(日本NIKON)，PCR仪(英国Quanta Biotech)，7890A型气相色谱-5975C型质谱联用仪(美国Agilent Technologies)，AL104-IC电子天平(美国 Mettler Toledo)，HH-4数显恒温水浴锅，KQ-500DE 数控超声发生器(昆山市超声仪器有限公司)，JY02S紫外分析仪(北京君意东方电泳设备有限公司)，陶瓷可调温熏香炉。

试剂主要有：沉香对照药材来自中国食品药品检定研究院(121222-201203)，Insect gDNA kit(美国Biomiga)，Es Taq Master Mix(北京康为世纪生物科技有限公司)，G254薄层层析板(德国Merck)；水合氯醛、正己烷、乙醚、三氯甲烷和95%乙醇均为分析纯。

1.2.2虫漏沉香虫源的分子鉴定 用Biomiga insect gDNA kit试剂盒提取待鉴定昆虫幼虫头部肌肉组织的基因组DNA。以基因组DNA为模板，对其线粒体细胞色素C氧化酶亚基I (mtDNA COI，COI)基因片段进行PCR 扩增，扩增引物为：COI-F：5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′和COI-R：5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′，反应体系为20μL：DNA4μL，20μmoL/L的引物各0.5μL，Es Taq Master Mix10μL，ddH2O5μL。反应参数为94℃预变性5min，94℃30s，55℃30s，72℃30s，35个循环。琼脂糖凝胶电泳检测后回收产物送至北京三博远志生物有限公司测序。将测序结果经拼接后于NCBI进行BLAST，并选出相似度较高的几个序列，用MEGA5.05软件构建系统发育树。

1.2.3虫漏沉香感官评价方法 对收集的沉香样品从外形(形状、完整性及虫道特征)、颜色(深浅)、油性(结油度)、香味(浓淡与纯正性)进行评价。其中香味采用熏香法：用洁净刮刀从虫漏沉香样品上刮下约0.1g沉香粉末至可调温熏香炉，以100℃熏香，人闻判定。

1.2.4显微鉴定方法 取代表性样品约2g，装入包埋盒后置于70℃的水浴锅中水浴约6h，横切成薄片，置于水合氯醛透明液过夜，取出放于载玻片上，显微镜下观察样品的射线、导管和韧皮部等组织。

1.2.5虫漏沉香成分含量测定 醇溶性浸出物、特征图谱和沉香四醇含量的测定方法参照《中华人民共和国药典》一部2015版“沉香”[2]，分别对1～8号沉香样品进行测定。挥发油成分提取和GC-MS分析参考刘洋洋等[11]的方法。

2 结果

2.1虫漏沉香的虫源鉴定

田间被蛀干害虫危害的白木香树干，肉眼观察到形成了沉香(见图1a)。显微观察显示受害组织韧皮部和木射线含有棕色树脂(见图1b)。

注：a.受蛀干害虫蛀蚀的白木香树干；b.田间受害样品显微切片。图1 白木香受蛀干害虫危害后初步形成虫漏沉香

田间调查发现白木香蛀干类害虫主要有：天牛(如Acmaeopssp.)，以幼虫钻蛀白木香树干和树根危害，蛀蚀伤口呈黑褐色；木蠹蛾(如Zeuzerasp.)，蛀蚀伤口呈褐色或黑褐色，主要以幼虫钻蛀白木香树干危害；白蚁(Termitidae sp.)沿白木香树干筑泥道，并延着泥道蛀蚀危害白木香树干，蛀蚀伤口表面附着泥土，呈淡黄色。天牛和木蠹蛾类幼虫危害形成的虫漏沉香虫孔在1～2cm左右，虫孔表面亦为腐木，具有典型的管道状虫道，而且虫道可以相互交错。白蚁类危害的树干具有大小、形状各异的虫孔，虫孔表面为腐木，常带泥，没有典型的管道状的虫道。

将田间采集的昆虫标本做COI分子生物学鉴定，构建的系统发育树见图2。

虫漏沉香虫源系统发育树显示，鉴定的天牛幼虫(见图2a)与Acmaeopstestacea、Exocentrusadspersus和Acmaeopspratensis聚为一支，与三种昆虫的序列相似度分别为83%、84%和83%，同属于Acmaeops，为天牛科Cerambycidae花天牛亚科Lepturinae 眼花天牛属Acmaeops的昆虫。鉴定的木蠹蛾幼虫(见图2b)与Zeuzeraconferta、Zeuzeralineata和Zeuzeracofeae聚为一支，与这三种昆虫序列相似度分别为97%、96%和90%，初步判定为木蠹蛾科Cossidae豹蠹蛾属Zeuzera的昆虫。

2.2虫漏沉香的感官特征

品质评价的虫漏沉香主要从市场上购置，其感官特征见表2。形状有螺旋状、块状和片状等，均具有虫孔，虫孔多为圆形、椭圆和梭形等，表面为腐木状(见图3)。虫孔特征与野外调查观察到的虫蛀道特征相似。一般具有明显的清凉和甘甜香味，树根类虫漏沉香因根部在泥土中生长带有土腥味。

表2 沉香样品的感官特征

注：a.天牛幼虫COI基因系统发育树；b.木蠹蛾幼虫COI基因系统发育树.鉴定昆虫以黑圈标出图2 虫漏沉香虫源系统发育树

图3 沉香样品外观性状(1～8为样品编号)

2.3虫漏沉香的显微鉴定

虫漏沉香的显微切片结果显示，1～6号虫漏沉香均具有沉香的典型特征(见图4)，具木间韧皮部和木射线且充满树脂，此观察结果与刘培卫等[12]对白木香的显微结构观察结果一致，与对照的板头香和通体香也一致。白木对照则因不含树脂呈灰色。不同虫漏沉香的树脂充盈度不同。

注：a.韧皮部；b.木射线；c.导管.放大100倍。图4 1～8号沉香样品的显微切片和白木(ck)显微切片

2.4虫漏沉香主要成分的含量测定

2.4.1虫漏沉香的醇浸出物和沉香四醇含量 特征图谱测定结果显示(见图5)，6份虫漏沉香样品均具有与对照沉香药材相对应的6个特征峰，其中峰1为沉香四醇。相比较对照药材及通体香和板头香，虫漏沉香的成分种类更多些。

图5 1～8号沉香样品的特征图谱(ck为对照沉香药材)

6份虫漏沉香样品的醇浸出物含量均远高于《中华人民共和国药典》[2]10%的标准，2号和4号样品更高达35%以上(见图6)，醇浸物含量的高低与感官评价的等级基本一致；3号虫漏样品虽然醇浸物含量较低，但外观较好。

图6 1～8号沉香样品醇浸物和沉香四醇相对含量折线图

6份虫漏沉香样品的沉香四醇含量均高于《中华人民共和国药典》规定的0.10%标准，但与醇浸物含量不完全对应，2号样品的浸出物含量达35.95%，而沉香四醇含量只有0.10%，刚好达到《中华人民共和国药典》要求。通体香的沉香四醇含量最高，而板头香最低只有0.07%，未达到《中华人民共和国药典》要求。

2.4.2虫漏沉香的挥发油单体成分相对含量 将1～8号样品进行GC-MS分析，比对出了134、112、109、97、140、142、110和160个化合物。从中选出了20种特征化学成分(18种为倍半萜类化合物，见表3)。

20种成分中，所有样品和对照共有的成分有6种：苄基丙酮(benzylacetone)、2，6-二叔丁基对甲酚(butylated hydroxytoluene)、香橙烯(alloaromadendrene)、马兜铃烯(aristolene)、别香橙烯氧化物(alloaromadendrene oxide)和异香橙烯环氧化物(isoaromadendrene epoxide)。虫漏沉香有而通体香和板头香没有的成分有4种：guaia-1(10)，11-diene、g-cadinene、guaia-3，9-diene和木香烃内酯(costunolide)。只有cycloisolongifolene是所有虫漏沉香共有的，但相对含量不高。因此虫漏沉香与通体香、板头香的成分种类差异较大，且不同虫漏沉香之间的挥发油成分也有较大差异。

表3 沉香挥发油主要特征化学成分及其相对含量/%

3 讨论

由于田间直接采集到优质虫漏沉香已极难，更无法同时采集到优质虫漏沉香及正在危害的昆虫等。因此本研究从初步形成了虫漏沉香的新鲜树木中捕捉危害昆虫并进行鉴定。由于虫漏沉香的外形特征非常典型，不会和其他伤害诱导形成的沉香混淆，因此虫漏沉香特征观察和品质分析则采用了从市场上收集的虫漏沉香样品。

本文报道了可诱导结香的蛀干类昆虫，鉴定出其中二种蛀干昆虫为天牛科眼花天牛属昆虫和木蠹蛾科豹蠹蛾属昆虫，其在对白木香树干蛀食过程中，会产生虫漏沉香，研究尚未见有类似报道。植物在受到外界伤害包括机械伤害、昆虫危害、微生物侵染等时，会产生一系列防御反应，抵御外界不良因子的进一步危害[13]。昆虫的取食、产卵、蛀巢等除引起机械性伤口还会从口腔引入唾液等分泌物[14]，其中可能含有能够触发植物特异性防御反应的昆虫特异性激发子(insect specific elicitors)，可激发特异性信号网络，诱导植物产生防御性次生代谢物质，如倍半萜类、棉酚和单宁等化合物[15]。研究认为天牛、木蠹蛾等昆虫对白木香植物的啃食在造成机械伤害、形成虫道同时，其口腔分泌物或排泄物中的特异性激发子触发了白木香的防御反应，在伤口及其周围组织产生了倍半萜类防御性次生代谢产物，与木材复合即成为了虫漏沉香。

本文对市场采集的虫漏沉香的感官特征和内在品质性状进行了比较研究。目前市场上对虫漏沉香的品质评价一般依据感官特征，主要包括外形、颜色、油性、香味等，并据此确定市场售价。形大完整、虫道特征明显、色深及油性好、香味纯的市场评价好，售价高。本研究从显微特征、醇浸出物和沉香四醇相对含量、挥发性成分GC-MS等对虫漏沉香进行了较系统评价，油性较好的沉香醇浸出物含量高，木间韧皮部和木射线中油脂填充度较好。另外，虫漏沉香具有多个与板头香和通体香不同的挥发性成分，说明了虫漏沉香的品质独特性。但不同虫漏沉香的挥发性成分种类差异也较大，这也从一个侧面说明了纯自然形成的沉香品质(化学成分)差异较大。虫漏沉香具有明显的清凉味和蜜香甜味，有报道指出创木烷型倍半萜具有令人愉悦的类似大马酮的杉木香和花香，并带有淡淡樟脑的清凉气息[16]，虫漏沉香的清凉味可能与其挥发油中的创木烷型倍半萜如guaia-1(10)，11-diene和guaia-3，9-diene等成分有关。

虫漏沉香还没有明确的定义，课题组提出如下定义，供业界参考：虫漏沉香(Chong-Lou agarwood，可简称为虫漏)为瑞香科沉香属植物树体受到天牛、木蠹蛾或白蚁等蛀干类昆虫蛀蚀伤害形成的含有树脂的木材，具有圆形或者椭圆形的虫孔、弯曲交错的虫道(木蠹蛾、天牛幼虫等蛀食)或者大小各异、形状不规则的虫孔(白蚁等蛀食)，蛀蚀面具有腐木。

致谢：本研究采集于田间白木香的蛀干类害虫标本，经中国农业大学刘星月教授鉴定为天牛科和木蠹蛾科。特此感谢！

[1] Chen H Q，Wei J H，Yang J S，etal.Chemical constituents of agarwood originating from the endemic genusAquilariaplants [J].Chem Biodivers，2012，9：236-250.

[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2015：185-186.

[3] 李时珍(明).本草纲目[M].下册.第1版.北京：人民卫生出版社，1982：1936-1940.

[4] 蔡绦.铁围山丛谈[M].北京：中华书局，1983：98.

[5] 赵学敏.本草纲目拾遗[M].北京：中国中医药出版社，2007：191.

[6] 张争，杨云，魏建和，等.白木香结香机制研究进展及其防御反应诱导结香假说[J].中草药，2010，41(1)：156-159.

[7] 安娜贝拉，陈颖，许敏，等.沉香的质量评价及药理活性研究进展[J].中国野生植物资源，2014，33(2)：1-5.

[8] Kalita J，Bhattacharyya P R，Boruah H D，etal.Association ofZeuzeraconfertaWalker on agarwood formation inAquilariamalaccensisLamk[J].Asian J.Plant Sci.Res，2015，5(1)：4-9.

[9] Liu Y Y，Chen H Q，Yang Y，etal.Whole-tree agarwood-inducing technique：an efficient novel technique for producing high-quality agarwood in cultivatedAquilariasinensistrees[J].Molecules，2013，18(3)：3086-3106.

[10]魏建和，杨云，张争，等.输液法在白木香树上生产沉香201010104119.5 [P].

[11]刘洋洋，杨云，林波，等.四批通体香沉香药材的挥发油成分分析[J].化学与生物工程，2014，31(5)：67-71.

[12]刘培卫，杨云，张玉秀，等.白木香结香过程中阻隔层的形成及其特性研究[J].植物研究，2016，36(5)：697-704.

[13]Martinez-medina A，Flors V，Heil M，etal.Recognizing plant defense priming[J].Trends Plant Sci，2016，21(10)：818-822.

[14]Vandoorn A，Baldwin I T，Bonaventure G.Lipoxygenase-mediated modification of insect elicitors：generating chemical diversity on the leaf wound surface[J].Plant Signaling and Behavior，2010，5(167)：4-6.

[15]Bonaventure G.Plants recognize herbivorous insects by complex signalling networks[J].Annual Review of Plant Biology，2014，47：1-36.

[16]杨德兰，梅文莉，杨锦玲，等.GC-MS分析4种奇楠沉香中致香的倍半萜和2-(2-苯乙基)色酮类成分[J].热带作物学报，2014，35(6)：1235-1243.

StudyontheCharacteristicsandQualityEvaluationofAgarwoodInducedbyHerbivorousInsects

GU Xiaohui1，2，4，WANG Guoquan2，ZHOU Yakui3，YANG Yun3，LIU Yangyang3，LIU Peiwei3，FENG Jian3，GAO Zhihui1*，WEI Jianhe1，3*

(1.Key Laboratory of Bioactive Substances and Resources Utilization of Chinese Herbal Medicine，Ministry of Education & National Engineering Laboratory for Breeding of Endangered Medicinal Materials，Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Science & Peking Union Medical College，Beijing 100193，China；2.Agricultural College，Guangxi University，Nanning 530004，China；3.Hainan Provincial Key Laboratory of Resources Conservation and Development of Southern Medicine & Key Laboratory of State Administration of Traditional Chinese Medicine for Agarwood Sustainable Utilization，Hainan Branch Institute of Medicinal Plant，Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College，Haikou 570311，China4.Guizhou Vocational College of Agriculture，Guiyang 551400，China)

Objective：To clarify the characteristics and quality of the “Chong-Lou” agarwood.Methods：The field investigation of “Chong-Lou” agarwood produced by xylophagous insects ofAquilariasinensiswas carried out.“Chong-Lou” agarwoods from the market were collected and their sensory and microscopic characteristics，content of alcohol soluble extract，agarotetrol and the volatile oil were analyzed.Results：The xylophagous insects collected from the “Chong-Lou” agarwood from the field include CerambycidaeAcmaeopsand CossidaeZeuzera.The “Chong-Lou” agarwoods from the markets had unique insect channel and can be identified easily，and sweet and cool odor.Their woody phloem and wood rays were filled with oil.Their content of alcohol soluble extract was higher than CK and the highest was up to 38.35%.While their agarotetrol content was relatively low than CK and had not positive correlation with the alcohol soluble extract content.Some volatile oil compositions，such as g-cadinene；guaia-3，9-diene and costunolide，were found only in “Chong-Lou” agarwood，not in “Tongti” and “Bantou” agarwood.However，the volatile oil compositions were also quite different between “Chong-Lou” agarwoods.Conclusion：This paper first reported that “Chong-Lou” agarwood can be induced by Cerambycidae，Cossidae and Termitidae etc.Two species of xylophagous insects were identified for the first time.The sensory and microscopic characteristics and the chemical compositions characteristics of “Chong-Lou” agarwood are also first reported.Some chemical compositions in“Chong-Lou” agarwood is unique compared to other induced agarwood.

Agarwood；Chong-Lou Agarwood；insect source；sensory characteristics；quality evaluation

国家自然科学基金资助项目(81673545，81673549)；海南省重大科技计划项目(ZDKJ2016004)；中组部“万人计划”(99950534)

] 高志晖，副研究员，研究方向：药用植物次生代谢调控研究，Tel：(010)57833363，E-mail：huihuigao@163.com；魏建和，研究员，研究方向：药用植物基因资源、分子育种及次生代谢产物调控研究，Tel：(010)57833016，E-mail：wjianh@263.net

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.8.003

2017-07-16)

*[