路立里，韩 冰，陈春华，刘宜勇，张 宁

（1.新疆畜牧科学院，乌鲁木齐 830000；2.农业部草食家畜遗传育种与繁殖重点实验室，乌鲁木齐 830000；3.新疆伊犁州畜禽改良站，伊宁 835000）

哈萨克羊GDF9、ESR、BMPR-IB基因的PCR-RFLP多态性研究

路立里1，韩 冰2，陈春华3，刘宜勇3，张 宁2

（1.新疆畜牧科学院，乌鲁木齐 830000；2.农业部草食家畜遗传育种与繁殖重点实验室，乌鲁木齐 830000；3.新疆伊犁州畜禽改良站，伊宁 835000）

为了探索绵羊多胎性的分子机理以及为绵羊繁殖力的标记辅助选择和育种提供理论依据，特开展了哈萨克羊品种多胎主效基因筛选和标记辅助育种研究。实验采用PCR-RFLP方法，对哈萨克羊GDF9、ESR、BMPR-IB基因进行PCR-RFLP多态性检测。结果表明：在哈萨克羊群体中GDF9、ESR、BMPR-IB基因的酶切位点上均未发现多态性，说明GDF9、ESR、BMPR-IB基因的酶切位点均不能作为控制哈萨克羊繁殖力的潜在分子标记位点。

哈萨克羊；GDF9基因；ESR基因；BMPR-IB基因；多态性

绵羊的繁殖性能是一个重要的经济性状，在群体内表现连续变异，是由一系列主基因或数量性状基因座（quantitative trait locus，QTL）决定的［1］，且遗传力只有0.1左右，很难用常规的技术来提高。目前，国内外提高绵羊繁殖性能最常见的方法是利用基因工程等技术进行分子育种，从根本上改变其繁殖性能，而找到与繁殖性能相关的分子标记位点是实现这个目标的基础。

开展哈萨克羊品种多胎主效基因筛选和标记辅助育种研究，可为哈萨克羊品种的开发利用及遗传资源的保护提供理论依据，也必将有力地推动和加速哈萨克羊多胎品系的选育步伐，因此，具有重要的理论意义和重大的应用价值。本实验以哈萨克羊为实验材料，采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）方法对GDF9、ESR、BMPR-IB基因进行多态性检测与分析，查找哈萨克羊在该基因酶切位点中的多态性，并对具有多态性的DNA片段进行测序分析，以期在该基因中找到与哈萨克羊产羔性状相关的遗传标记位点，为开展标记辅助选择提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究所需哈萨克羊（150只）由尼勒克县提供。颈静脉采血，ACD抗凝，供提取绵羊基因组DNA。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA的提取 参照《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》［2］以及常规酚-氯仿抽提法提取血液基因组DNA。

1.2.2 引物设计和PCR扩增 参照GenBank中绵羊GDF9基因（登录号：NM_001142888.2）、ESR基因（登录号：XM_015097472.1）、BMPR-IB基因（登录号：NM_001009431.1），利用Olig 6.0和Primer 5.0设计引物如表1。

表1 检测哈萨克羊多胎候选基因的引物

PCR扩增体系为25μL，包括：10×PCR缓冲液2.5 μL，10 pmol/L引物 0.5μL，dNTPs 2.0μL，2.5 U/μL Taq DNA聚合酶0.25μL，100 ng/μL的DNA模板1.0μL，其余用水补齐至25μL。

1.2.3 PCR扩增条件 94℃预变性3 min；94℃变性30 s，62～55℃退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环，72℃延伸10 min；4℃保存，产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.4 PFLP分析 5μL PCR扩增产物；1.5μL 10× Buffer；0.5μL限制性内切酶；3μL水。

反应条件：37℃水浴4 h左右；3%琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，并在凝胶成像仪上成像观察结果，并保存图像。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增结果

2.1.1 GDF9基因的PCR扩增结果 用GDF9基因引物对哈萨克羊基因组DNA进行PCR扩增，扩增产物片段与目的片段大小一致（139 bp）（图1）。结果表明：特异性良好，可直接用于RFLP分析。

图1 GDF9基因的PCR产物

2.1.2 ESR基因的PCR扩增结果 用ESR基因引物对哈萨克羊基因组DNA进行PCR扩增，扩增产物片段与目的片段大小一致（115 bp）（图2）。结果表明：特异性良好，可直接用于RFLP分析。

2.1.3 BMPR-IB基因的PCR扩增结果 用BMPR-IB基因引物对哈萨克羊基因组DNA进行PCR扩增，扩增产物片段与目的片段大小一致（140 bp）（图3）。结果表明：特异性良好，可直接用于RFLP分析。

图2 ESR基因的扩增结果

图3 BMPR-IB基因的酶切结果

2.2 PCR-RFLP结果

2.2.1 GDF9基因的PCR-RFLP结果 用Dde I内切酶对GDF9基因所扩的PCR产物进行酶切，用3%琼脂糖电泳对酶消化产物进行检测，得到108 bp条带（图4）。

图4 GDF9基因的PCR产物酶切结果

2.2.2 ESR基因的PCR-RFLP结果 用BSP1 286 I内切酶对ESR基因所扩的PCR产物进行酶切，用3%琼脂糖电泳对酶消化产物进行检测，野生型完全被切开，产生92 bp大小的片段（图5）。本实验在哈萨克羊群体中发现ESR基因的PCR-RFLP的所有结果均为野生型，没有多态性。

2.2.3 BMPR-IB基因的PCR-RFLP结果 用AvaⅡ内切酶对BMPR-IB基因所扩的PCR产物进行酶切，用3%琼脂糖电泳对酶消化产物进行检测，没有发现被切开片段（图6）。

图5 ESR基因产物消化结果

图6 BMPR-IB基因的酶切结果

3 讨论

绵羊的繁殖性状是其重要的经济性状之一，而繁殖性状属于低遗传力性状，是由主效基因以及微效多基因控制的，因此发现与鉴定多胎候选基因和主效基因对提高绵羊数量及建立多胎品系具有重要作用。哈萨克羊产羔数为1～4羔，提高哈萨克羊产羔率及产羔数具有重要的经济意义。故研究哈萨克羊的多态机理有重大的科学价值，但至今仍未发现影响哈萨克羊多胎性状的基因，本研究以GDF9、ESR和BMPR-IB为候选基因，以期找到影响哈萨克羊多胎性状的SNP位点。

GDF9（growth diferentiation factor 9，GDF9）基因是TGF-β（transforming growth factor beta）超家族中的一员，是第一个被发现由卵母细胞分泌的生长因子，它通过旁分泌方式对卵泡的生长分化起着重要作用，因此对动物的繁殖也起着重要作用。Hayashi等［3］在体外培养体系中发现，重组GDF9能诱导大鼠的腔前卵泡生长，且与FSH一起使用时对卵泡生长起加性作用。Hanrahan等［4］扩增Cambridge绵羊和Belclare绵羊GDF9基因共发现了8个SNP，其中位于编码区1 184 bp处的碱基突变C→T导致位于编码区第395个氨基酸残基由丝氨酸改变为苯丙氨酸，氨基酸的改变导致了GDF9基因功能的改变。Hanrahan等［4］根据影响绵羊繁殖力基因的命名法则，将GDF9基因编码区1 184 bp处的碱基突变命名为FecG。国内的学者在小尾寒羊、湖羊、陶赛特羊和萨福克羊中发现，GDF9基因第152碱基A突变为G，导致天冬酰胺改变为天冬氨酸。

ESR基因（estrogen receptor，ESR）是核受体超家族的一员，具有转录调控蛋白质的功能，影响雌激素基因在雌性脊椎动物组织的表达与调控，是依赖配体活化的转录因子，通过与靶基因上特异性效应元件结合，调节靶基因的表达。近年来，国内的学者们开始研究多胎绵羊的ESR基因。对高繁殖力绵羊品种小尾寒羊、湖羊的研究结果表明，ESR基因可能是控制小尾寒羊和湖羊多胎性能的一个主效基因或与之存在紧密的遗传连锁［5］。

BMPR-IB基因（bone morphogenetic protein receptor IB，BMPR-IB）是编码一个转移生长因子β亚基（TGF-β）受体家族的成员，存在于许多细胞类型中，在绵羊卵巢的卵母细胞和颗粒细胞中特异性表达，具有影响颗粒细胞分化和卵泡发育、促进排卵数增加的作用［6］。国内外学者对该基因做了大量的研究，并证实该基因是控制部分绵羊高繁殖性状的主效基因［7］。杨华等［8］的研究表明，A746G突变对中国美利奴羊（军垦型）高产羔数的影响达到极显著程度（P<0.01），能够作为其高繁殖力绵羊的选择标记位点。BMPR-IB基因是控制Booroola绵羊等高繁殖力品种绵羊的主效基因［7，9］。

本实验利用PCR-RFLP方法，对150个不同繁殖力的哈萨克羊群体的GDF9、ESR和BMPR-IB基因的酶切位点进行了多态性检测。结果发现：在哈萨克羊群体中GDF9、ESR、BMPR-IB基因的酶切位点上均未发现多态性，表明GDF9、ESR、BMPR-IB基因的酶切位点均不能作为控制哈萨克羊繁殖力的潜在分子标记位点。这与国内外的大量研究有差异。说明由于地域差异，自然选择或者人工选择对哈萨克羊多胎基因分布的影响较大，这可能与育种中的个体选择有关，需要扩大采样范围或者扩大样品量进一步进行深入的研究。

4 结论

4.1 GDF9基因的FecGH位点多态性

通过PCR-RFLP检测结果表明，在哈萨克羊群体中GDF9基因的FecGH位点不存在多态性，说明哈萨克羊多胎性状与GDF9基因的FecGH位点无关。

4.2 ESR基因的多态性

通过PCR-RFLP检测ESR基因，结果表明，该位点在哈萨克羊群体中出现的均是野生型基因型，不存在多态性，说明ESR基因不是哈萨克羊的多胎主效基因。

4.3 BMPR-IB基因的多态性

通过PCR-RFLP检测结果表明，在哈萨克羊群体中该酶切位点不存在多态性，说明哈萨克羊多胎性状与多胎基因BMPR-IB无关。

［1］ 田秀娥，孙红霞，王永军.3个绵羊群体BMPR-IB基因的遗传多态性及其对产羔数的影响［J］.西北农林科技大学学报（自然科学版），2009，11（37）：31-36.

［2］ 萨姆布鲁克，EF弗里奇，马尼阿蒂斯EF.分子克隆实验指南［M］.沈桂芳，毛江森，译.2版.北京：科学出版社，1992.

［3］ Hayashi M，McGcc E A，Min G，et al.Reconitinant growth differentiation factor 9（GDF-9）enhances growth and differentiation of cultured early ovarian folliceles［J］.Endocrinology，1999，140（3）：1236-1675.

［4］ Hanrahan J P，Gregan S M，Mulsant P，et al.Mutations in the genes for oocyte-derived growth factors GDF9 and BMP15 are associated with both increased ovulation rate and sterility in Cambridge and Belcalaer sheep［J］.Biol Reprod，2004，70：900-909.

［5］ 毕晓丹，储明星，金海国.小尾寒羊高繁殖力候选基因ESR的研究［J］.遗传学报，2005，10（5）：46-48

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PCR-RFLP Polymorphisms of GDF9，ESR，BMPR-IB Genes in Kazakh Sheep

Lu Lili1，Han Bing2，Chen Chunhua3，etal
（1.Xinjiang Academy ofAnimalSciences，Urumchi830000，China；2.KeyLaboratoryofGenetics，Breedingand ReproductionofGrassFeedingLivestock，MinistryofAgriculture，Urumchi830000，China；3.The Livestock ImprovementStation ofYiliState，Yining 835000，Xinjiang，China）

To explore the molecular mechanism of prolificacy and providing theoretical basis for marker-assisted selection and breeding offecundity in sheep，PCR-RFLP wasused to detectpolymorphismsof GDF9，ESR and BMPR-IB genesin Kazakh sheep. The resultsshowed thatthe gene polymorphismswere notfound on GDF9，ESR and BMPR-IB genes restriction enzyme sites and these sites could notbe considered as a potentiallocus tocontrolreproduction ofKazakh sheep.

Kazakh sheep；GDF9 gene；ESR gene；BMPR-IB gene；polymorphism

S826.2

A

2095-3887（2017）05-0006-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2017.05.002

2017-06-20

路立里（1975-），男，副研究员，硕士。研究方向：动物遗传育种与改良。