郭 宪，包鹏甲，胡显忠，丁学智，吴晓云，阎 萍，裴 杰

（1.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，兰州 730050；2.甘肃省科学院，兰州 730000）

遗传育种与繁殖

西藏亚东牦牛线粒体DNA分析及系统进化研究

郭 宪1，包鹏甲1，胡显忠2，丁学智1，吴晓云1，阎 萍1，裴 杰1

（1.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，兰州 730050；2.甘肃省科学院，兰州 730000）

应用基因测序技术对西藏亚东牦牛线粒体基因组进行测序，并对测序数据质控与修剪及基因组组装、精细注释、功能注释与分析。结果表明：亚东牦牛线粒体基因组大小约为15 389 bp，包含13个PCGs、21个tRNAs、2个rRNAs及1个D-loop，其A+T碱基含量为60.86%，G+C碱基含量为39.14%；编码基因（PCGs、tRNAs&rRNAs）片段总长度为14 495 bp，占基因组总长度的94.19%；同时，分析了亚东牦牛与其他11个物种间的进化关系，发现亚东牦牛与甘南牦牛归为一类，亲缘关系最近。西藏亚东牦牛线粒体DNA分析为研究牦牛群体遗传、起源与分子进化提供了技术参考。

牦牛；线粒体DNA；系统进化

牦牛是分布于青藏高原及其毗邻地区的特有牛种资源，可提供肉、乳、毛绒等，是高寒牧区的基本生产生活资料。牦牛对高寒、缺氧等生态环境具有极强的适应能力，在低氧适应遗传上是一个极为宝贵的基因库，研究牦牛基因组和亲缘关系对牦牛遗传资源的保护与合理开发利用具有重要的意义。线粒体DNA是分子生物学研究中的重要分子标志之一。亚东牦牛线粒体基因组测序分析及系统进化研究有助于更好地了解牦牛特别是西藏牦牛群体遗传进展与进化历史。

1 材料与方法

1.1 样品采集与基因组DNA提取

从西藏自治区日喀则地区亚东县放牧牦牛群中，随机选择成年健康的母牦牛6头，采集血液样品，冷冻保存带回实验室。采用动物血液基因组DNA提取试剂盒（Tiangen）提取样品基因组DNA，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度，-20℃保存备用。

1.2 PCR扩增和目的基因测序

根据GenBank公布的普通牛线粒体DNA全序列（登录号NC_006853）设计6对引物，引物序列及扩增片段大小见表1［生工生物工程（上海）股份有限公司合成］。PCR扩增反应条件：94℃预变性4 min，然后94℃变性30 s、55℃退火40 s、72℃延伸4 min，循环30次，最后72℃延伸10 min。PCR反应总体积为50μL，其中LA Taq预混合酶25μL，DNA模板2μL（100 ng/μL），上下游引物各1μL（10 pmol/μL），灭菌ddH2O 21μL。PCR扩增后，其产物在1%的琼脂糖凝胶电泳分离，用胶回收试剂盒回收、纯化PCR产物后，送往百迈客生物科技有限公司，按照Illumina公司提供的标准protocol执行，利用样品的基因组 DNA构建 500 bp文库，在 Hiseq 2500测序平台双向测序。

表1 牦牛mtDNA扩增引物

1.3 数据处理与分析

对测序产生的原始reads进行评估，再通过过滤低质量、纠错等方法得到高质量的reads，scaffold补gap引物序列见表2，反应条件和程序同1.2。然后使用Velvet软件［1］进行基因组的组装，使用Repeat Masker软件［2］对细菌基因组进行重复序列的屏蔽，使用软件DOGMA（http：//dogma.ccbb.utexas.edu/）对组装后的基因组进行基因预测，使用GENEIOUS R8（Biomatters Ltd.，Auckland，New Zealand）软件对线粒体基因组进行注释，并通过MEGA软件［3］构建进化树，研究物种间的进化关系。

表2 scaffold补gap引物序列

1.4 基因功能注释

利用预测得到的基因序列与COG［4］、KEGG［5］、GO［6］等功能数据库做BLAST比对，进行基因的COG功能富集分析、GO功能富集分析等基因功能注释分析。

2 结果

2.1 基因组组装结果

利用得到的高质量Pair-end数据基于Kmer分布图进行基因组大小的评估，17-mer总数为5 272 946 280，平均kmer深度为329 100，估计基因组大小约16 022 bp。使用Velvet软件对高质量数据进行组装，共得到5条1 kb以上的基因组序列，将5条contig根据与近缘物种比对后的位置信息，拼装成一条基因组序列，总长15 389 bp，具体见表3。A+T碱基含量为60.86%，G+C碱基含量为39.14%。编码基因（PCGs、tRNAs& rRNAs）片段总长度为15 389 bp，占基因组总长度的94.19%。

表3 牦牛线粒体基因组注释

2.2 基因组注释

使用RepeatMasker软件对细菌基因组进行重复序列屏蔽，预测到亚东牦牛简单重复序列占30.1%，小重复序列占69.9%。通过DOGMA软件分析，亚东牦牛含13个编码基因序列，23个非编码基因序列（2个rRNA和21个tRNA），具体基因组注释结果见图1。

2.3 基因功能注释

利用预测得到的基因序列与COG、GO等功能数据库做BLAST比对，进行基因的COG功能富集分析、GO功能富集分析等基因功能注释分析，结果分别见图2、图3。

图1 亚东牦牛线粒体基因组注释结果示意图

图2 COG分类统计结果

图3 GO注释聚类统计结果

2.4 物种间进化关系分析

使用亚东牦牛线粒体和其他11个物种线粒体的核酸序列，通过MEGA软件构建进化树，研究物种间的进化关系，12个线粒体之间的进化关系见图4。结果显示，亚东牦牛（156）与甘南牦牛（登录号KJ704989）归为一类，亲缘关系最近。与大通牦牛（GenBank登录号KJ463418）、无角牦牛（GenBank登录号KM658599）亲缘关系较近，与野牦牛（GenBank登录号KM233417）次之，与其他牛属物种间均较远。

图4 基于亚东牦牛线粒体序列（156）的系统发育树

3 分析与讨论

线粒体是一种存在于所有真核动物细胞中的半自主性细胞器，由内膜、外模、基质和突出的嵴构成。在线粒体内部存在着线粒体自身的遗传物质——线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）和一些与有氧呼吸有关的酶［7］。动物线粒体DNA的特点是：①分子量小、结构简单、编码效率高。线粒体DNA一般为长度约5μm的共价双链环状分子，结构紧凑。②母系遗传，基因间重组小。线粒体DNA遵循母性遗传，即子代的线粒体DNA完全是来自于母本。③变异率高，进化速度快。线粒体DNA是直接裸露的环状DNA分子。D-Loop区位于tRNApro和tRNAphe之间，因不编码基因，其产生的突变可以不断地得到积累而对线粒体的功能不产生影响，因此具有更大的进化速率。④遗传密码特殊。⑤无组织特异性。本研究中，测得西藏亚东牦牛线粒体长度为15 389 bp，包含13个PCGs、21个tRNAs、2个rRNAs及1个D-loop，其A+T碱基含量为60.86%，G+C碱基含量为39.14%。编码基因（PCGs、tRNAs&rRNAs）片段总长度为14 495 bp，占基因组总长度的94.19%。本研究获得的结果，与其他大多数哺乳动物的线粒体DNA结构基本一致，为研究西藏亚东牦牛的群体遗传和进化历史提供了基础数据。

线粒体DNA在牛上的研究与应用非常广泛，主要是通过对线粒体DNA遗传变异产生的多态性的研究，以了解牛品种的进化历史、分类地位和相互关系，并应用于品种种质鉴定、系统进化、物种起源与分化等方面，为资源保护和品种改良及利用提供技术参考。本研究通过对亚东牦牛线粒体DNA的COG、GO分析，证实了线粒体在体内处于新陈代谢和能量转换的中心地位，可产生体内约90%的ATP。GO总共有3个本体（ontology），分别描述基因的分子功能（molecular function）、所处的细胞位置（cellular component）、参与的生物过程（biologicalprocess）。本研究同时分析了亚东牦牛与其他11个物种之间的进化树关系，结果表明亚东牦牛与甘南牦牛归为一类，说明其亲缘关系最近；与大通牦、无角牦牛亲缘关系较近，与野牦牛次之，与其他牛属物种间均较远。

线粒体DNA是一种核外遗传物质，与核DNA相比，具有分子量小、结构简单、进化速度快、母性遗传、无组织特异性及提取方便等特点，使得其成为研究动物起源进化及群体遗传分化的理想对象。随着现代分子生物学技术的发展，人们对线粒体和线粒体DNA的研究将更加深入，从而使研究牦牛的起源进化、系统发育和种质资源保护更有利于人类需要的方向发展。

［1］ Zerbino D R，Birney E.Velvet：algorithms for the de novo short read assembly using de Bruijn graphs［J］.Genome Research，2008，18：821-829.

［2］ Chen N.Using repeat masker to identify repetitive elements in genomic sequences［M］.Curr Protoc Bioinformatics，USA：John Wiley＆Songs，Inc.2004.

［3］ Koichiro Tamura，Joel Dudley，Masatoshi Nei，et al.MEGA4：Molecular Evolutionary Genetics Analysis（MEGA）software version 4.0［J］.Molecular Biology and Evolution，2007，24：1596-1599.

［4］ Tatusov R L，Galperin MY，Natale D A，et al.The COG database：a tool for genome-scale analysis of protein functions and evolution［J］. Nucleic Acids Research，2000，28（1）：33-36.

［5］ Kanehisa M，Goto S，Kawashima S，etal.The KEGG resource for deciphering the genome［J］.Nucleic Acids Research，2004，32（Sl）：277-280.

［6］ Ashburner M，Ball C A，Blake J A，et al.Gene Ontology：tool for the unification ofbiology［J］.Nature Genetics，2000，25（1）：25-29.

［7］ 孟彦，许尚忠，昝林森.线粒体DNA在牛遗传育种的应用[J].家畜生态学报，2006，27（1）：92-95.

Analysis on Phyletic Evolution and MitochondrialDNA of Yadong Yak（Bosgrunniens）in Tibet

Guo Xian，Yan Ping，PeiJie，etal
（Lanzhou Institute ofHusbandry and PharmaceuticalSciences，Chinese Academy ofAgriculturalSciences，Lanzhou 730050，China）

The complete mitochondrialgenome sequence of Yadong yak（Bos grunniens）in Tibethas been sequenced by gene sequencing technique，the sequencing data were analyzed by quality control and pruning，genome assembly，fine annotation，functionalannotation and analysis.The resultsshowed thatthe complete mitochondrialgenome ofYadongyak in Tibetwas15 389 bp，which contained 13 protein-coding genes，21 tRNA genes，2 rRNA genes and a non-coding controlregion（D-loop region）.The overallbase paircomposition were 60.86%A+T and 39.14%G+C，the totallength ofcoding genes（PCGs，tRNAs&rRNAs）were 14 495 bp，accounting for 94.19%ofthe totallength ofgenome.Atthe same time，the mtDNA of Yadong yak were analyzed with otherevolutionary relationships between 11 species，the resultshowed that Yadong yak and Gannan yak were classified as a class. The mitogenome sequence of Yadong yak would contribute to better population genetics protection and evolution understanding of Bos grunniens.

yak；mitochondrialDNA；phyletic evolution

S823.2

A

2095-3887（2017）05-0001-06

10.3969/j.issn.2095-3887.2017.05.001

2017-07-17

现代农业（肉牛牦牛）产业技术体系建设专项（CARS-37）；甘肃省科技支撑计划项目（1504NKCA052）；中国农业科学院创新工程（CAAS-ASTIP-2014-LIHPS-01）

郭宪（1978-），男，副研究员，博士。研究方向：动物遗传资源与繁育。

阎萍，研究员，博士；裴杰，副研究员，博士。