冯晓燕，何琳，孙志茹

（河北省保定市第二医院 1.核医学科，2.妇产科，河北 保定 071051；3.河北省定兴县云峰妇产医院 妇产科，河北 定兴 072650）

KLF9在上皮性卵巢癌组织中的表达及其临床意义

冯晓燕1，何琳2，孙志茹3

（河北省保定市第二医院 1.核医学科，2.妇产科，河北 保定 071051；3.河北省定兴县云峰妇产医院 妇产科，河北 定兴 072650）

目的探讨Krüppel样转录因子9（KLF9）在上皮性卵巢癌中的表达及其临床意义。方法选取63例有完整临床病理资料及随访＞5年的石蜡包埋上皮性卵巢癌组织和正常卵巢上皮组织。采用实时荧光定量聚合酶链反应检测KLF9 mRNA在两组卵巢组织中的表达，应用免疫组织化学法分析KLF9在两组卵巢中的表达，分析KLF9表达水平与临床病理参数及患者预后的关系。结果63例卵巢癌组织中，KLF9 mRN为正常上皮组织的（0.44±0.693）倍（P＜0.05）。上皮性卵巢癌组织中，KLF9高表达15例（23.8%），低表达48例（76.2%）；在正常卵巢组织中，KLF9高表达18例（60%），低表达12例（40%），差异有统计学意义（P＜0.05）。癌组织中KLF9低表达与上皮性卵巢癌患者的临床分期、淋巴结转、腹腔积液相关（P＜0.05）。KLF9 mRNA高表达组中位生存时间46.8个月（95%CI：26，83），高于低表达组的32.6个月[（95%CI：12，74），P=0.002]。肿瘤组织中KLF9阳性细胞高表达组的中位生存时间为50.2个月（95%CI：32，84），高于KLF9低表达组的31.1个月[（95%CI：12，79），P=0.001]。多因素COX生存分析表明，KLF9 mRNA和KLF9阳性细胞低表达是影响上皮性卵巢癌预后不良的独立指标[HR=2.64（95%CI：1.14，3.56），P=0.017]和[HR=3.01（95%CI：2.19，4.51），P=0.010]。结论KLF9在上皮性卵巢癌组织中表达下调，与上皮性卵巢癌患者预后不良相关。

KLF9；上皮性卵巢癌；预后；临床意义

Kruppel样转录因子9（Kruppel-like transcrip tion factors 9，KLF9）是KLF转录因子家族成员之一[1]，广泛参与细胞的增殖、分化、发育等重要生理过程[2]。研究证实，KLF9在多种肿瘤组织中表达，并通过多种信号途径影响肿瘤的增殖和凋亡[3]。目前KLF9在上皮性卵巢癌中的表达和生物学作用还未见相关报道，本实验检测KLF9在上皮性卵巢癌患者肿瘤组织的表达水平，研讨KLF9在上皮性卵巢癌患者中发挥的临床效果，探讨KLF9在上皮性卵巢癌发生、发展中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2009年5月-2011年5月河北省保定市第二医院妇产科存档的上皮性卵巢癌患者卵巢癌组织蜡块63例，所有患者具有完整临床病理资料及随访＞5年，经组织病理学证实，其中浆液性癌39例，黏液性癌20例，子宫内膜癌3例，透明细胞癌1例。按照国际妇产科联盟（the International Federation ofgynecology and Obstetrics，FIGO）2000年病理分期标准，Ⅰ期14例，Ⅱ期11例，Ⅲ期33例，Ⅳ期5例。病理分化程度：低分化23例，高分化40例。全部患者术前未接受放化疗、免疫治疗及烟酒、毒物等危险因素。患者年龄23～68岁，中位年龄43.7岁。30例正常对照组织蜡块为因子宫肌瘤行子宫加附件切除患者的正常卵巢上皮组织标本，患者年龄25～66岁，中位年龄为42.8岁。所有患者签署知情同意书，并报医院伦理委员会通过。

1.2 总RNA提取

将石蜡包埋的组织切成厚20μm的薄片，取5张切片常规脱蜡，55℃蛋白酶K消化6h后，进行总RNA提取，完全按照试剂盒（美国ABI公司）说明书操作。焦碳酸二乙酯（diethy pyrocarbonate，DEPC）水溶解后，使用分光光度计测定RNA的浓度和纯度。

1.3 逆转录反应

将10μl总RNA、2μl dNTPmix、2μl Oligo（dT）18充分混匀后，65℃预变性5 min，然后迅速冷却，加入5×RT缓冲液4μl、Ribonuclease Inhibitor1μl，最后加入鼠白血病逆转录酶 1μl（200 u/μl）至终体积为20μl，42℃变性1 h，70℃退火10 min，冰上冷却，获得的cDNA第1链，立即行实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）或置入-80℃冰箱冷冻保存，待用。

1.4 qRT-PCR

KLF9正向引物：5'-ACAGTGGCTGTGGGAAAG TC-3'，反向引物：5'-TCACAAAGCGTTGGCCAGCG-3'。内参β-actin正向引物：5'-GACTACCTCATGAAgATCCTCACC-3'，反向引物：5'-TCTCCTTAATGTCA CGCACGATT-3'。PCR扩增条件：95℃预变性10 s，95℃变性5 s，60℃退火41 s，共40个循环，均设置复孔3个。采用相对定量法，癌组织和正常组织中目的基因的相对表达量以2-ΔΔCt表示，ΔΔCt=癌组织（CtKLF9-Ctβ-actin）-正常组织（CtKLF9-Ctβ-actin）。

1.5 免疫组织化学法

将石蜡包埋的组织块切成4μm厚的薄片，按照化学发光链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法（streptavidin-perosidase，SP）检测试剂盒说明书操作，用柠檬酸缓冲液（pH 6.0），在高压抗原热修复预处理切片，阴性对照用磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline，PBS）代替一抗。兔抗人KLF9多克隆抗体（1∶100，ab26074）购自美国Abcam公司。结果判定：细胞核或细胞浆呈棕黄色和/或棕褐色证明KLF9为阳性表达。用奥林巴斯光学显微镜和Image-Pro Plus V 6.0图像分析软件进行统计分析。在低倍镜下寻找细胞分布均匀的区域，然后在高倍镜（400倍）下进行阳性细胞计数，随机计数5个高倍视野的阳性细胞数目，取平均值以阳性细胞数/高倍视野（high power field，HPF）表示。染色结果分析：细胞数＜1个为阴性（-），1～5个为弱阳性（+），6～19为阳性（++），≥20个为强阳性（+++），以（-）（+）为低表达，（++）（+++）为高表达。

1.6 统计学方法

数据分析采用SPSS 16.0统计软件和X-tile 3.6.1分析软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，用t检验或方差分析，绘制Kaplan-Meier生存曲线，生存率的比较做Log-rank χ2检验，影响因素分析用Cox回归模型，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 KLF9在上皮性卵巢癌组织中的表达

63例卵巢癌组织中KLF9 mRNA与正常上皮组织比较，差异有统计学意义（t=19.02，P=0.000），卵巢癌组织中KLF9 mRNA的表达为正常上皮组织的（0.44±0.693）倍（见图1）。免疫组织化学法结果显示，KLF9蛋白阳性染色主要定位于细胞核和细胞质，呈棕黄色或棕褐色颗粒或团块，染色均一。在卵巢癌组织和正常组织均可检测到KLF9蛋白的表达。63例卵巢癌组织标本中，KLF9高表达15例（23.8%），低表达48例（76.2%）；在正常上皮组织中，KLF9高表达18例（60%），低表达12例（40%），差异有统计学意义（χ2=11.622，P=0.001）。直线相关分析表明，卵巢癌患者肿瘤组织中KLF9 mRNA水平与组织中KLF9阳性细胞呈正相关（r=0.354，P=0.028）。见图2。

图1 KLF9 m R N A表达水平比较 （n=63）

图2 KLF9在上皮性卵巢癌组织中的表达 （免疫组织化学法×200）

2.2 KLF9表达水平与临床病理特征的关系

对卵巢癌组织中KLF9的表达因素进行分析，KLF9 mRNA在Ⅰ、Ⅱ期、低腹腔积液量患者中表达升高（P＜0.05）；KLF9阳性细胞在无淋巴结转移、临床分期Ⅰ和Ⅱ期，以及腹腔低积液量患者中表达阳性率较高（P＜0.05）。见表1。

2.3 KLF9表达水平与上皮性卵巢癌预后的关系

所有患者随访至2016年5月，中位随访时间为66个月。以KLF9 mRNA表达水平中位值2-ΔΔCt= 0.323作为截断值，Kaplan-Meier生存分析结果表明，KLF9 mRNA高表达组总生存率延长；高表达组生存率达48.6%，中位生存时间为46.8个月（95%CI：26，83），低表达组生存率为24.5%，中位生存时间32.6个月（95%CI：12，74），经Log-rank χ2检验，差异有统计学意义（χ2=8.645，P=0.002）（见图3）。利用X-tile软件将KLF9在上皮性卵巢癌组织中的表达分为高表达组和低表达组，KLF9高表达组患者的生存率为46.2%，中位生存时间为50.2个月（95%CI：32，84），KLF9低表达组生存率为20.6%，中位生存时间31.1个月（95%CI：12，79），经Log-rank χ2检验，差异有统计学意义（χ2=12.36，P=0.001）。单因素分析表明，KLF9 mRNA和KLF9阳性细胞低表达是上皮性卵巢癌预后不良指标之一[HR=3.287，（95%CI：2.14，5.78），P=0.006；HR=4.792（95%CI：2.72，7.16），P=0.003]。多因素COX生存分析表明，KLF9 mRNA和KLF9阳性细胞低表达是影响上皮性卵巢癌预后不良的影响因素[HR=2.64（95%CI：1.14，3.56），P=0.017；HR=3.01（95%CI：2.19，4.51），P=0.010]。见表2。

表1 不同临床病理特征卵巢癌组织中KLF9表达水平及阳性率比较

续表1

表2 C ox多因素比例风险模型分析影响患者生存的危险因素

图3 KLF9表达水平与卵巢癌预后的关系

3 讨论

上皮性卵巢癌是女性常见的生殖系统恶性肿瘤之一，发病高峰年龄为50岁左右。由于卵巢位于盆腔底部，肿瘤发病隐匿、早期病变难以发现，因此，＞70%上皮性卵巢癌患者诊断时已属晚期[3]。更为严重的是，相当一部分患者治疗后仍会复发，导致其5年生存率≤30%[4-5]。因此阐明特定基因在上皮性卵巢癌中的表达调控规律，对研究上皮性卵巢癌发病机制及其临床干预具有重要意义。

KLF即Kruppel样转录因子，因其DNA结合区域与果蝇属胚胎发育调控因子Kruppel高度相似而得名[6]。目前已发现≥20种KLFs，KLF家族在机体重要组织器官的发育，以及细胞的增殖、分化、凋亡、周期调控等方面发挥重要作用。近年来研究表明，KLF也参与机体肿瘤的发生、发展[7]。KLF9主要通过其羧基末端的3个经典且高度保守的Cys2/His2锌指结构结合DNA，发挥基因调控作用[1]。研究发现，KLF9基因敲除后不影响小鼠的正常生长，其生长表型与野生型无差异，但是雌性KLF9基因缺失小鼠的生殖系统出现缺陷，子宫发育和生殖能力受影响，因此KLF9在子宫分化发育中发挥重要作用[8]。近年来发现，KLF9在多种人类肿瘤中也存在表达，并逐渐被认为是一个潜在的抑癌基因。YING等[9]通过全基因组分析发现KLF9是一个转录抑制子，可以调控多条与肿瘤发生、干细胞调节有关的信号通路，KLF9通过抑制ITGA6通路抑制神经母细胞瘤的生长。SUN等[10]研究表明，KLF9在人肝癌组织中表达下调，并且与P53基因表达相关。另外，KLF9能够通过抑制AKT信号通路抑制前列腺癌的生长[11]。这些研究提示，KLF9是一种具有抑制肿瘤生长和转移的新型抑癌基因。

本实验应用qRT-PCR检测上皮性卵巢癌石蜡包埋组织中KLF9的表达水平。研究结果显示，KLF9在上皮性卵巢癌组织的表达量低于正常卵巢上皮组织。进一步应用免疫组织化学法检测KLF9在肿瘤原位的表达，结果显示，KLF9蛋白阳性染色主要定位于细胞浆，呈棕黄色或棕褐色颗粒或团块，染色均一。在癌组织和相应正常组织均可检测到KLF9蛋白的表达，但是KLF9在癌组织的表达水平低于正常组织。该结果与前人在肝癌[10]、肠癌[11]、胰腺癌[12]、乳腺癌[13]中的研究结果一致。张建新等[12]报道，KLF9在胰腺癌组织中的表达水平低于癌旁正常胰腺组织。田野[13]和GAWRYCHOWSKI等[14]发现，乳腺癌组织和浸润性细胞系中KLF9表达下调[13-14]。结果表明，KLF9在肿瘤的发生、发展中发挥抑癌基因的作用。

在本研究中，肿瘤组织KLF9的异常表达与上皮性卵巢癌患者临床分期、淋巴结转移、腹腔积液密切相关。KLF9表达水平越低，临床分期越晚，越容易出现淋巴结转移，腹腔积液量越多。表明KLF9具有抑制上皮性卵巢癌生长和转移的作用。BROWN等[15]研究发现，KLF9通过抑制干扰素相关信号通路抑制结肠癌细胞的生长。HUANG等[16]在神经胶质瘤中敲除KLF9后，促进细胞增殖和小鼠体内肿瘤的生长，其机制是下调miR-21分子。另外，在本研究中，生存分析也证实该推论，上皮性卵巢癌组织中KLF9阳性细胞高表达者，总生存率延长，生存时间较低表达者延长达20个月。Cox多重回归分析表明，KLF9低表达是上皮性卵巢癌预后不良的独立指标之一，表明KLF9低表达可以作为上皮性卵巢癌预后不良的独立指标。关于KLF9在上皮性卵巢癌发生、发展中的机制还有待进一步研究。

本研究结果表明，KLF9在上皮性卵巢癌组织中表达下调，与上皮性卵巢癌的临床分期、淋巴结转移密切相关，KLF9低表达可以作为上皮性卵巢癌预后不良的独立指标。

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（童颖丹 编辑）

Expression and clinical significance of KLF9 in patients with epithelial ovarian carcinoma

Xiao-yan Feng1,Lin He2,Zhi-ru Sun3
(1.Department of Nuclear Medicine,2.Department ofgynaecology and Obstetrics,the Second Hospital of Baoding,Baoding,Hebei 071051,China;3.Department ofgynaecology and Obstetrics,Yunfeng Maternity Hospital of Dingxing County,Dingxing,Hebei 072650,China)

ObjectiveTo investigate the expression of Krüppel-like transcription factor 9 (KLF9)in epithelial ovarian carcinoma and its clinical significance.MethodsSixty-three formalin-fixed paraffinembedded samples from epithelialovarian carcinoma patients with 5-year follow-up and detailed clinicopathological information were selected.The expressions of KLF9 mRNA and protein were detected by qRT-PCR and immunohistochemistry respectively.The relationships of KLF9 with the clinicopathological factors and the prognosis were analyzed.MethodsThe expression of KLF9 mRNA in the epithelial ovarian carcinoma tissues significantly decreased as compared with that in the normal ovarian tissues (P＜0.05). Compared with the normal tissues,the tumor tissues showed a higher rate of KLF9 low-expression (P＜0.05). The low-expression of KLF9 was associated with TNM stage,lymph node metastases and ascetic fluid (P＜0.05).The overall survival of the KLF9 mRNA high-expressiongroup was 46.8 months (95%CI:26,83), which was significantly longer than 32.6 months (95%CI:12,74)of the KLF9 mRNA low-expressiongroup (P＜0.05).In the cancer tissues,the overall survival of the KLF9-positive cell high-expressiongroup was50.2 months (95%CI:32,84),which was significantly longer than 31.1 months (95%CI:12,79)of the KLF9-positive cell low-expressiongroup (P＜0.05).Cox regression analysis showed that KLF9 mRNA and KLF9-positive cell low-expression were the poor prognostic markers for epithelial ovarian carcinoma [HR= 2.64(95%CI:1.14,3.56),P=0.017;HR=3.01(95%CI:2.19,4.51),P=0.010].ConclusionsThe expression of KLF9 is down-regulated in epithelial ovarian carcinoma which is associated with poor prognosis,therefore, KLF9 may serve as a tumor suppressor in the development of epithelial ovarian carcinoma.

KLF9;epithelial ovarian carcinoma;prognosis;clinical significance

R737.31

A

2016-12-06

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.20.008

1005-8982（2017）20-0040-06