王永伦，封忠昕，葛晓军

（遵义医学院附属医院 检验科，贵州 遵义 563003）

BAFF受体在人B淋巴瘤细胞中的作用研究*

王永伦，封忠昕，葛晓军

（遵义医学院附属医院 检验科，贵州 遵义 563003）

目的测定B细胞活化因子（BAFF）受体在人B淋巴瘤细胞中的表达水平，探讨B细胞活化因子受体（BAFF-R）信号转导在人淋巴瘤细胞中的作用。方法选取3种人B淋巴瘤细胞系Raji、Daudi、BALL-1，通过流式细胞术、实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）及Western blot检测BAFF的表达。结果流式细胞术结果显示，在3种人B淋巴瘤细胞系中均检出BAFF-R阳性表达，qRT-PCR和Western blot检测显示，在3种人B淋巴瘤细胞系中，BAFF-R基因与蛋白表达水平上调。结论人B淋巴瘤细胞系Raji、Daudi、BALL-1呈阳性表达，BAFF-R与B淋巴瘤细胞的生长、增殖关系密切。

B细胞活化因子；B细胞活化因子受体；B淋巴瘤细胞

B细胞活化因子（B cell-activating factor，BAFF）是肿瘤坏死因子（tumour necrosis factor，TNF）家族成员之一，在B淋巴细胞的分化和增殖中发挥关键作用，有3个受体分别为B细胞成熟抗原、跨膜激活剂及钙调素亲环素配体相互作用分子，以及BAFF细胞活化因子受体（B cell-activating factor recipient，BAFF-R）。研究表明，BAFF受体的特异性较高，不仅只在B细胞中表达，而且只专一地结合BAFF，而不与TNF家族中的其他成员结合，是BAFF调控B细胞分化的主要介导受体[1-2]。虽然BAFF与血液疾病的关系已进行大量研究，但是BAFF-R是否在B淋巴瘤细胞中广泛表达，尚未见报道。本研究拟选择3种人B淋巴瘤细胞系Raji、Daudi、BALL-1，检测细胞中BAFF的表达，为探讨BAFF-R在B淋巴瘤细胞发生、发展中起到的调控机制奠定研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料

人B淋巴瘤细胞系Raji、Daudi与BALL-1购自美国ATCC，由本室保存。无血清细胞冷冻保存培养基（roswell park memorial institute 1640，RPMI 1640）和胎牛血清购自美国gibco公司，细胞培养箱（美国Thermo公司），RNA抽提试剂盒（日本TaKaRa公司）；细胞裂解液Trizol试剂（美国Invitrogen公司），实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR） 试剂盒、SsoAdvanced SYBRgreen Supermix荧光定量试剂盒、qRT-PCR仪购自美国Bio-Rad公司，FITC anti-human CD268（BAFF-R）Antibody（美国Bio Legend公司），流式细胞仪（美国BD Bioscience公司），细胞蛋白提取试剂选择无线电免疫沉淀（radio-immunoprecipitation assay，RIPA）蛋白裂解液（中性）（北京中山金桥生物科技有限公司），蛋白定量仪（美国Thermo公司），抗BAFF-R抗体（美国CST公司），抗β-actin抗体、山羊抗小鼠IgG HRP二抗及山羊抗兔IgG HRP抗体购自北京中山金桥生物科技有限公司，蛋白电泳仪与转膜仪（美国Bio-Rad公司），放射自显影仪（虎丘影像科技苏州有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 从液氮中取出冻存细胞，37℃迅速融化。1 500 r/min离心3 min，弃上清液，用培养液清洗1遍，离心后弃上清，重悬于含10%热灭活小牛血清的RPMI 1640培养液中37℃、5%二氧化碳CO2孵箱常规培养。

1.2.2 流式细胞术 分别选取5×105个状态良好的对数生长期淋巴瘤细胞，磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗涤细胞3次后，PBS重悬细胞，按照说明书要求加入 FITC anti-human CD268（BAFF-R）流式抗体，避光孵育15 min后，PBS洗涤细胞3次，上流式细胞仪检测BAFF-R的表达。阴性对照细胞使用未染色的淋巴瘤细胞。

1.2.3 总RNA的提取和qRT-PCR 提取收集实验所需细胞的RNA。反应体系：5×Prime ScriptTMBuffer（for real-time）6.0μl，Prime ScriptTMRT Enzyme MixⅠ1.5μl，Random 6 mers（100μmol/L）1.5μl，Oligo Dt Prime（r50μmol/L）1.5μl，总RNA 19.5μl，总反应体积为30μl。

37℃、15 min逆转录，85℃、5 s灭活逆转录酶。逆转录产物cDNA放置于-20℃冰箱冷冻保存。按说明书进行qRT-PCR，取1μl逆转录产物cDNA进行PCR扩增。反应总体积为20μl，内含SYBRPremix Ex TaqTM10μl，引物混合液正反向引物各1μl，1‰ DEPC水8μl。PCR反应条件：95℃预变性30s，95℃变性5 s，60℃退火30 s，共40个循环。人BAFF-R和内参β-actin qRT-PCR引物如下：人BAFF-R正向引物（22 bp）：5'-AATCTCTGATGCCAC AGCTCCT-3'，反向引物（19 bp）：5'-TATTGTTGCTCAgGGCCGG-3'；人β-actin正向引物（20 bp）：5'-CCA CGAAACTACCTTCAACTCC-3'，反向引物（20 bp）：5'-GTGATCTCCTTCTGCATCCTGT-3'。实验结果以2-△△Ct相对值来反映基因表达的改变。

1.2.4 细胞总蛋白的制备和Western blot检测 收取对数生长期的细胞，并以0.1mol/L pH 7.4的冷PBS离心洗涤，并重悬3次。加入300μl RIPA蛋白裂解液（中性），冰上放置30 min或冰上超声破碎10 s，4℃、13 000 r/min离心30 min，小心吸取上清液。用Mini Drop 2000分光光度计测定提取蛋白浓度，置入-70℃冰箱冷藏备用。

Western blot检测：配制分离胶和积层胶，浓缩胶8%，分离胶分别为10%和15%。蛋白样品与Loading buffer按1∶4混和后于沸水中煮沸3～8 min。取10～20μl蛋白上样进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，浓缩胶80 V，分离胶120 V。湿转法将蛋白转到聚偏二氟乙烯膜上，恒压100V。5%脱脂奶粉于室温封闭2 h或4℃过夜。5%脱脂奶粉稀释一抗（1∶500～1∶1 500，按抗体说明书要求稀释），37℃摇床孵育2 h或4℃孵育过夜，三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液（tris buffered saline and tween 20，TBST）洗3次，10～15 min/次。稀释辣根过氧化物酶标记二抗（1∶10 000），37℃摇床孵育1 h，TBST洗3次，10～15 min/次。加入显影液，放射自显影检测目的条带。β-actin为内参对照。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组比较用单因素方差分析，两两比较用LSD-t检验，P＜0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BAFF-RmRNA在3种人B淋巴瘤细胞系中的表达

Raji、Daudi及BALL-13种人B淋巴瘤细胞系BAFF-R mRNA水平与对照组比较，差异有统计学意义（F=1.176、2.150和1.601，均P=0.000）,在Raji、Daudi及BALL-1细胞系中，BAFF-RmRNA水平较对照组细胞（293T细胞系）呈现出高表达状态，各细胞系中BAFF-R mRNA相对表达量较对照组细胞提高约4倍。在3种人淋巴瘤细胞系中，Raji与Daudi的BAFF-R mRNA表达水平比较，差异有统计学意义（t=1.829，P=0.002），而Raji与BALL-1、Daudi与BALL-1的BAFF-R mRNA表达水平比较，差异无统计学意义（F=1.362和1.343，P=0.120和0.330）。见图1。

2.2 BAFF-R蛋白在3种人B淋巴瘤细胞系中的表达

与对照组细胞比较，BAFF-R蛋白表达水平在3种人B淋巴瘤细胞系中呈现高表达状态。该结果与qRT-PCR结果一致，进一步从蛋白水平确定，BAFF-R在Raji、Daudi与BALL-1细胞系中存在高表达现象。本实验使用Image J图像处理软件对Western blot检测结果进行灰度分析，求出各条带的灰度值。BAFF-R相对表达量比值=BAFF-R灰度值/β-actin灰度值，计算得到各组细胞中BAFF-R表达量占细胞总蛋白量的比值，并对各组蛋白总量比值进行统计学分析。Raji、Daudi及BALL-1 3种人B淋巴瘤细胞系BAFF-R蛋白表达水平与对照组比较，差异有统计学意义（F=1.262、3.208和2.936，均P=0.000），3种人B淋巴细胞瘤细胞系中BAFF-R蛋白表达水平高于对照组。3组人B淋巴细胞瘤细胞系间比较，Raji与Daudi细胞系BAFF-R蛋白表达比较，差异无统计学意义（t=2.542，P=0.526），Raji与BALL-1、Daudi与BALL-1细胞系BAFF-R蛋白表达比较，差异有统计学意义（t=2.326和1.093，均P=0.000）。见图2。

图1 Raji、Daudi、BALL-1细胞系及对照组BAFF-R转录水平

2.3 BAFF-R在3种人B淋巴瘤细胞系中的阳性表达

为确定BAFF-R在Raji、Daudi及BALL-1细胞系中的表达率，本实验使用流式细胞术检测3种细胞系BAFF-R的表达情况，以阴性峰为参照，区分出BAFF-R阳性细胞。3种细胞系细胞表面BAFF-R均呈现阳性表达，表达率分别为62.11%、87.84%和99.75%（G1=M1）。实验结果显示，Raji、Daudi及BALL-1细胞系中，BAFF-R均呈阳性表达。见图3。

图2 3种人B淋巴瘤细胞系和对照组BAFF-R蛋白的表达

图3 人B淋巴细胞瘤细胞系R aj i、D audi及BALL-1细胞中BAFF-R表达阳性

3 讨论

BAFF又称BLys、THANK、TALL-l、TNFsF13B及zTNF4，是1999年发现的TNF家族的B细胞激活因子，作用于外周B淋巴细胞，具有调节B淋巴细胞池的大小和功能，促进B淋巴细胞的分化、增殖、抗原呈递及Ig转换和基因重组，增强B细胞、CD4+T淋巴细胞及NK细胞的功能的功能，从而使机体的免疫应答增强[3-4]。BAFF胞外段存在长约150个氨基酸的保守结构域，以β片层形式形成三聚体，与受体结合，通过结合BAFF-R发挥其生物学作用[5-6]。

BAFF-R作为BAFF受体之一，表达于过度T2型B淋巴细胞及边缘区、滤泡成熟B2细胞群上的Ⅰ型跨膜蛋白受体，属于TNF受体超家族成员[7]。B淋巴瘤细胞的增殖转移受BAFF信号通路的调节，而BAFF-R作为BAFF信号通路的上游关键信号分子，在B淋巴瘤细胞的增殖中起重要的作用[8-9]。研究显示，BAFF-R不仅表达于成熟的B淋巴细胞，而且见于B淋巴瘤细胞表面，在刺激B淋巴瘤细胞增殖、避免B淋巴细胞凋亡等方面，发挥极其重要的作用[10-11]。

有实验表明，特发性血小板减少性紫癜（idiopathic thrombocytopenic purpura，ITP）患儿血清中BAFF的表达和外周血单个核细胞中BAFF mRNA表达高于正常对照组，BAFF可能参与ITP发病机制[12]。B细胞性非霍奇金淋巴瘤患者BAFF的基因和蛋白表达水平高于健康对照组，且与组织亚型有关，在弥漫性大B细胞淋巴瘤、小B细胞恶性淋巴瘤及滤泡性淋巴瘤中表达较高，推测BAFF与B细胞非霍奇金淋巴瘤发生、发展密切相关[13]。在儿童初发急性淋巴细胞白血病血浆中，BAFF及其受体的基因和蛋白表达水平比健康对照组增高，缓解期患儿比初发组下降，推测BAFF及其受体与儿童急性淋巴细胞白血病发生、发展相关[14]。陈娟等[15]研究发现，BAFF-R基因和蛋白表达于MM细胞中，BAFF-R干预多发性骨髓瘤KM3细胞株后，可促进KM3细胞增殖，抑制凋亡，推测BAFF-R对多发性骨髓瘤的发生、发展发挥一定作用。帅小博等[16]研究结果证实以上观点，且进一步发现BAFF-R定位在KM3细胞的细胞膜上；重组人BAFF能够促进BAFF-R基因和蛋白的表达，认为重组人BAFF对BAFF-R表达有重要的影响。

本研究选取3种人B淋巴瘤细胞系Raji、Daudi及BALL-1，通过qRT-PCR、Western blot检测及流式细胞术，从基因到蛋白水平，着重探讨BAFF-R在人B淋巴瘤细胞系Raji、Daudi及BALL-1中的表达水平。实验结果显示，Raji、Daudi及BALL-1细胞系中BAFF-R均呈高表达，提示BAFF-R与人B淋巴瘤细胞的生长、增殖关系密切，为今后进一步研究BAFF信号通路在人B淋巴瘤细胞中具体机制做基础铺垫。

参 考 文 献：

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[2]LIN W,SESHASAYEE D,LEE W P,et al.Dual B cell immunotherapy is superior to individual anti-CD20 depletion or BAFF blockade in murine models of spontaneous or accelerated lupus[J].Arthritis Rheumatology,2015,67(1)：215-224.

[3]ASSI L K,WONG S H,LUDWING A,et al.Tumor necrosis factor alpha activatas release of B lymphocyte stimulator by neutrophils infiltrating the rheumatoid joint[J].Arthritis Rheumatology, 2007,56(6)：1776-1786.

[4]SUN J,LIN Z,FENG J,et al.BAFF-targeting therapy,a promising strategy for treating autoimmune diseases[J].European Journal of Pharmacology,2008,597(1)：1-5.

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[15]陈娟,郭悦华,鞠少卿,等.多发性骨髓瘤中BAFF-R表达及其对细胞存活影响的研究[J].现代检验医学杂志,2014,29(3)：12-15.

[16]帅小博,鞠少卿,申娴娟,等.重组人BAFF对多发性骨髓瘤细胞BAFF-R表达调控的初步研究[J].南通大学学报（医学版）,2015, 35(1)：24-26.

（童颖丹 编辑）

BAFF-R expression in B cell lymphoma*

Yong-lun Wang,Zhong-xin Feng,Xiao-junge
(Clinical Laboratory,the Affiliated Hospital of Zunyi Medical College, Zunyi,Guizhou 563003,China)

ObjectiveTo detemine the expression of B-cell activating factor receptor (BAFF-R)in B cell lymphoma and to explore the role of BAFF-R signal transduction in B cell lymphoma.MethodsHuman B-cell lymphoma cell lines Raji,Daudi and BALL-1 were selected as the objects of study.BAFF-R expression was detected by flow cytometry,qRT-PCR and Western blot.MethodsFlow cytometryMethodsdemonstrated that BAFF-R was up-regulated in all the three cell lines,qRT-PCR and Western-blot indicated the sameMethods.ConclusionsBAFF-R expression is up-regulated in all the three B-cell lymphoma cell lines,and closely correlated to thegrowth and proliferation of B-cell lymphoma.

B-cell activating factor,B-cell activating factor receptor,B-cell lymphoma

R733.7

A

2016-05-19

国家自然科学基金（No：81560487）；贵州省科学技术基金 [No：黔科合J（2011）2264]

葛晓军，E-mail：gxj_199421@163.com

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.20.003

1005-8982（2017）20-0011-05