王海霞，曹 炜，张 聪，智 恺，武子英，刘立玲，果 彤，燕美彤(. 中国中医科学院广安门医院，北京 0005； . 中国中医科学院，北京 00700； . 北京中医药大学，北京 0009)

【实验研究】

清热活血方对II 型胶原诱导型关节炎大鼠相关指标的影响研究❋

王海霞1，曹 炜2△，张 聪2，智 恺2，武子英1，刘立玲1，果 彤3，燕美彤3
(1. 中国中医科学院广安门医院，北京 100053； 2. 中国中医科学院，北京 100700； 3. 北京中医药大学，北京 100029)

目的： 观察清热活血方对II 型胶原诱导型关节炎大鼠血管内皮生长因子(vegf)、白细胞介素-6(IL-6)的影响，探讨清热活血方对类风湿关节炎滑膜血管新生的抑制机理。方法： 应用免疫组化技术检测CD31在CIA大鼠膝关节滑膜组织中的表达，ELISA法检测CIA大鼠血清中血管内皮生长因子和白细胞介素的表达，并观察清热活血方对其的影响。结果： 用免疫组化法检测微血管数量发现，清热活血方中、小剂量组与模型组比较微血管数量明显减少，清热活血方大剂量组与模型组比较微血管数量减少，差异有统计学意义。CIA大鼠血清vegf、IL-6检测中，与模型组比较清热活血方中、小剂量组vegf表达降低，清热活血方中剂量组IL-6表达降低明显。结论: 中小剂量的清热活血方通过下调VEGF和IL-6的表达，可减少炎症细胞对滑膜的浸润，抑制血管新生，进而达到控制活动性RA病情的目的。

清热活血；类风湿关节炎；血管内皮生长因子；白细胞介素-6

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以侵蚀性关节炎为主要表现的全身性自身免疫病。本病表现为以双手、腕、膝、踝、足关节等小关节受累为主的对称性、持续性多关节炎。本实验采用II型胶原诱导型关节炎模型观察清热活血方对CIA大鼠关节病理、免疫组化及血清指标的影响，以揭示清热活血方对滑膜血管新生的作用机制。

1 材料

1．1 实验动物

清洁级雌性SD大鼠70只，体质量(200±20) g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司(动物合格证编号SCXK(京) 2012-0001)。SD大鼠在实验期间喂养于恒温、恒湿环境，自由饮水，饲料固定。

1．2 试剂及仪器

免疫源性牛II 型胶原(货号20021)、完全弗氏佐剂(货号7001)均购自 Chondrex公司，清热活血方由我院科研药房提供，vegf ELISA试剂盒购自abcam公司(货号ab100786)，IL-6 ELISA 试剂盒购自新博盛生物科技有限公司(货号ERC003)，抗CD31抗体购自R&D公司(货号AF3628)。

组织包埋机(型号HISTOSTAR)、石蜡切片机(型号RM2245)、切片染色机(型号ST5020)、手提式均质仪(型号IKA-T10 Basic Ultra-turrax)、荧光显微镜(型号BX50)、酶标仪(型号WellscanMK2)。

2 方法

2.1 清热活血方的制备

清热活血方组成：土茯苓30 g,金银花30 g，炒苍术15 g，黄柏9 g，赤芍15 g，萆薢15 g，丹参15 g，莪术9 g，青风藤15 g，生薏苡仁30 g，蜈蚣2条，蜂房5 g。按处方比例称取饮片加水中火煮沸后，文火煎煮30 min过滤取药汁，再加水按上述方法操作，将2次药汁混合浓缩至浓度2 g(生药)/mL。

2.2 动物分组及给药

将雌性SD大鼠70只按随机序列法分为正常对照组、CIA模型组、清热活血方低、中、高组(15、20、25 g生药/kg)、抑制剂ZD6474组(50 mg/kg)、MTX组(10 mg/kg)7组。自免疫第1天开始即给药，中药组按15、20、25 g生药/kg、抑制剂ZD6474组(50 mg/kg)进行灌胃，正常对照组与模型组灌服2ml生理盐水，每天1次，连续21 d。MTX组(10 mg/kg)灌胃每周2次，连续21 d。

2.3 CIA大鼠模型的建立

除正常对照组外，其余6组制备CIA模型。于大鼠尾根部皮下注射0.15ml胶原乳化剂，第7天加强免疫方法同前。正常组以等量生理盐水对照处理。

2.4 关节肿胀度测定

采用排水法测量大鼠足体积，每周测 2 次，直至实验结束。

2.5 细胞因子检测

大鼠腹主动脉取血，冰上静置2 h，2500 rpm离心15 min取血清，ELISA备用。

2.6 微血管密度测量

将大鼠滑膜组织放入10% 福尔马林固定2 h，将已固定的标本取出，经梯度酒精脱水、二甲苯透明，然后石蜡包埋。滑膜微血管密度(microvessel density，MVD)用1∶50稀释的CD31抗体标记血管内皮细胞。在200倍显微镜下观察滑膜微血管密度(microvessel density，MVD)，每张片选取3个血管集中视野拍照，并计数取均值。

2.7 关节病理

取双后肢踝关节去除附着皮毛组织，浸泡在 10%多聚甲醛(福尔马林)溶液中，隔天换液，5% 硝酸浸泡脱钙2周，每周换液 2次，至刀片能轻松切断骨质后重新浸泡至 10% 多聚甲醛溶液中，石蜡包埋、切片，HE染色。

2.8 统计学方法

3 结果

3.1 各组CIA大鼠关节肿胀度

图1表1显示，从首次免疫第10天开始，各组造模大鼠后肢关节出现不同程度的红肿，随时间推移关节肿大程度进一步加剧。与正常组比较，模型组大鼠关节肿胀明显(P<0.01)；在第18天左右，ZD6474组、MTX组、中药中、小剂量组大鼠关节肿大趋势得到抑制(P<0.01)。

图1 各组CIA大鼠关节肿大程度注：a. 正常组;b. 模型组；c. ZD6474组；d. MTX组；e.中药大剂量组；f.中药中剂量组；g.中药小剂量组

3.2 各组CIA大鼠关节病理

图2显示，白色箭头所示为骨关节面。关节病理可见，正常组关节面连续，骨小梁完整，未发现炎性细胞浸润；与正常组比较，模型组骨关节面中断、消失，骨小梁与近关节面骨端破坏，大量炎性细胞浸润。中药大剂量组与小剂量组骨关节缺损较多，并有大量炎性细胞浸润。其余3组虽有较多炎性细胞浸润，但骨关节面尚存，偶有不连续，近关节面骨端基本完整。

图2 各组CIA大鼠关节的破坏程度(HE 12.5×)注：a.正常组;b.模型组；c. ZD6474组；d. MTX组；e.中药大剂量组；f.中药中剂量组；g.中药小剂量组

3.3 各组CIA大鼠滑膜微血管密度和血清中VEGF、IL-6的表达水平

图3表1显示， CD31是分子量为 130KD的跨膜糖蛋白, 在血管内皮细胞的连接处表达水平较高。本实验用其定位血管内皮细胞，图3中浅色标记为阳性血管。与正常组比较，模型组血管数量明显增多(P<0.01)；与模型组比较，ZD6474组、MTX组、中药中剂量组、中药小剂量组微血管数量均显著减少(P<0.01)，中药大剂量组微血管数量也明显减少(P<0.05)。

图3 各组CIA大鼠滑膜微血管密度(MVD)(IHC-P 200×)注：a 正常组;b 模型组；c ZD6474组；d MTX组；e中药大剂量组；f中药中剂量组；g中药小剂量组

表1显示，与正常组比较，模型组大鼠血清VEGF与IL-6表达水平明显升高(P<0.01)；与模型组比较，MTX组、中药中剂量组大鼠血清中IL-6表达水平显著降低(P<0.05)；与模型组比较，ZD6474组、MTX组、中药中小剂量组大鼠血清中VEGF表达水平明显降低(P<0.05)。

4 讨论

RA在中医文献中被称为历节、鹤膝风、顽痹、尪痹等，属于中医“痹症”范畴，其发病以正虚为本、外感为标，并与患者体质、饮食及生活习惯等息息相关。临床观察发现，RA患者以湿热证多见，或外感湿热之邪，或风寒湿郁久化热， 或恣食肥甘厚味，湿热内生。湿热内蕴，炼液为痰，壅滞血脉，气血输注不利，瘀血内生，不能荣养四末筋骨，故见关节红肿疼痛、屈伸不利甚至关节畸形[1]。在RA活动期应用清热活血方，可起到清热活血、调节免疫的作用。

表1 各组CIA大鼠相关指标

注：与正常组比较：##P<0.01；与模型组比较*P<0.05，**P<0.01

RA发病首先侵犯关节滑膜，导致炎性细胞浸润和滑膜血管增生。增生的滑膜需要更多的血供以满足其对氧气和营养物质的需求，因而血管新生在血管翳形成和维持方面起关键性作用。

IL-6是由2条糖蛋白链组成的多肽，是参与机体免疫应答和免疫调节的重要细胞因子。RA患者的T细胞、B细胞等都可产生IL-6，IL-6诱导肝细胞合成多种急性时相蛋白，这些蛋白促进B细胞产生类风湿因子及多种免疫球蛋白使RA炎症加剧[2]。RA患者滑膜中IL-6、血清中slL-6R与慢性滑膜炎及关节损害程度呈正相关。将RA患者滑液中分离的成纤维细胞进行培养，IL-6及其sIL-6R共同作用可以提高VEGF水平，抗IL-6受体抗体可以降低VEGF水平[3]。另外，在RA患者中，血清IL-6的水平与C反应蛋白水平相关。IL-6的过表达可以使骨质吸收加速，形成减少[4]。VEGF是一种细胞来源广泛的多功能性糖蛋白，可促进内皮细胞迁移、增殖，在RA血管新生方面有重要作用[5-6]。VEGF 在RA中是联系各种炎性因子的枢纽，可直接促进滑膜血管新生并增加血管通透性。

本实验选取IL-6、VEGF和CD31作为观测RA炎症与血管新生的指标。实验结果显示，清热活血方可以明显减轻大鼠关节的肿胀程度。关节病理显示，清热活血方可抑制滑膜细胞的增殖，延缓或抑制骨破坏。ZD6474已证明，在抑制血管新生方面效果显著[7-9]，属于阳性药。最近有文献报道，MTX在抑制血管新生方面亦具有明显效果[10]。大鼠MVD测定中，模型组血管数量明显增多,清热活血方中剂量组、小剂量组对血管新生的抑制作用较为显著，清热活血方大剂量组对血管新生的抑制作用也较为明显。在细胞因子检测中，模型组大鼠血清中VEGF、IL-6表达量显著高于正常组,清热活血方中剂量组、MTX组大鼠血清中二者的表达量明显低于模型组，与模型组比较大鼠血清VEGF的表达水平也明显降低。而清热活血方大剂量组对血清VEGF、IL-6的作用不明显。综合来看，清热活血方中剂量组无论是在抑制炎症还是在抑制血管新生方面均较明显，小剂量组次之。

综上，中小剂量的清热活血方能够下调VEGF和IL-6的表达，减少炎症细胞对类风湿关节炎滑膜的浸润，抑制血管新生，从而达到控制活动期RA病情的目的。

[1] 刘小平, 侯秀娟, 朱跃兰, 等. 类风湿关节炎病因病机探讨[J]. 现代中医临床, 2014, 21(1): 19-20.

[2] 郑毅, 董馨, 陆江阳, 等. 类风湿关节炎滑膜中高迁移率族蛋白 1 的表达[J]. 中华风湿病学杂志, 2005, 9(11): 684-686.

[3] NAKAHARA H, SONG J, SUGIMOTO M, et al. Anti-interleukin-6 receptor antibody therapy reduces vascular endothelial growth factor production in rheumatoid arthritis[J]. Arthritis & Rheumatism, 2003, 48(6): 1521-1529.

[4] 王卓, 王瞳晖, 王泽. 白介素-6 及其受体在类风湿性关节炎中的作用[J]. 中国现代医药杂志, 2011, 13(2): 111-113.

[5] WARD M C, CUNNINGHAM A M. Developmental expression of vascular endothelial growth factor receptor 3 and vascular endothelial growth factor C in forebrain[J]. Neuroscience, 2015, 303: 544-557.

[6] 郑林, 肖涟波. HIF-1α和VEGF在类风湿关节炎中的作用[J]. 现代免疫学, 2016, 36(2): 162-165.

[7] 马虹, 丁乾. VEGF及EGFR抑制药联合放疗抑制肿瘤血管生成及DSB修复[J]. 临床药物治疗杂志, 2012, 10(2): 14-22.

[8] KIM Y, LI F, O’NEILL B E, et al. Specific binding of modified ZD6474 (Vandetanib) monomer and its dimer with VEGF receptor-2[J]. Bioconjugate chemistry, 2013, 24(11): 1937-1944.

[9] SARKAR S, RAJPUT S, TRIPATHI A K, et al. Targeted therapy against EGFR and VEGFR using ZD6474 enhances the therapeutic potential of UV-B phototherapy in breast cancer cells[J]. Molecular cancer, 2013, 12(1): 1.

[10] CHANG Y, PARK J W, SUNG S, et al. Volume-normalized transfer constant as an imaging biomarker for chronic inflammatory arthritis: A dynamic contrast enhanced MRI study[J]. Magnetic resonance in medicine, 2016, 76(3): 926-934.

国家自然科学基金面上项目(81373592)-基于血管新生miR-125b-PIGF/Flt1信号传导通路探讨清热活血法治疗活动期类风湿关节炎的分子免疫机制

王海霞(1988-)，女，河南人，医学硕士，从事类风湿关节炎的基础与临床研究。

△通讯作者：曹 炜，女，主任医师，医学博士，硕士研究生导师，从事类风湿关节炎的基础与临床研究，Tel:13601331063,E-mail:caowei6636@126.com。

R593.22

B

1006-3250(2017)08-1071-03

2017-02-12