刘盼 胡孟芬 赵新闻 柳雯 宋达琳

硝酸异山梨酯后处理对大鼠在体心肌缺血/再灌注损伤保护作用的研究

刘盼 胡孟芬 赵新闻 柳雯 宋达琳

目的 观察硝酸异山梨酯后处理对大鼠在体心肌缺血/再灌注损伤是否具有保护作用，并探讨其作用机制。方法 清洁级雄性Wistar大鼠，32只，10～12周龄。建立大鼠在体心肌缺血/再灌注模型，随机分为假手术组（sham组）、缺血/再灌注组（I/R组）、缺血后处理组（IPostC组）和硝酸异山梨酯后处理组（PPostC组）。测定各组大鼠心肌梗死面积，并用Elisa法测定大鼠血清肌钙蛋白I（cTnI）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）水平。结果 ①各组大鼠左室质量和缺血面积未见统计学差异。IPostC组及PPostC组与I/R组相比，心肌梗死面积减小，差异有统计学意义（P＜0.05）［（41.015±1.037）%、（38.129±0.726）%比（52.190±1.216）%］；而IPostC组与PPostC组之间未见统计学差异（P=0.057）。②与sham组相比，I/R组、IPostC组和PPostC组血清cTnI的水平显著升高（P＜0.05）；与I/R组相比，IPostC组和PPostC组的大鼠血清cTnI水平明显降低（P＜0.05），IPostC组和PPostC组相比未见统计学差异（P＞0.05）。③与sham组相比，I/R组、IPostC组及PPostC组血清MDA水平显著升高，SOD水平显著降低（P＜0.05）；与I/R组相比，IPostC组及PPostC组血清MDA水平降低，血清SOD水平显著升高（P均＜0.05）。结论 ①缺血后处理能够减轻大鼠在体心肌缺血/再灌注损伤；②硝酸异山梨酯后处理可以产生与缺血后处理相似的心肌保护效果；③硝酸异山梨酯的心肌保护作用机制可能与减少活性氧的产生及提高心肌的抗氧化（应激）能力有关。

缺血-再灌注损伤； 缺血后处理； 心肌保护； 硝酸异山梨酯

缺血再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury，IRI）是急性心肌梗死患者经皮冠状动脉介入治疗（percutaneous transluminalcoronary intervention，PCI）术后面临的主要问题，临床表现为梗死面积增加、再灌注心律失常、心肌顿抑等，并可导致最终梗死面积达50%以上[1,2]，能够抵消再灌注带来的所有益处。近年来有学者提出缺血后处理（IPostC）这一内源性的心肌保护机制，并证实可以减轻IRI[3]。2005年，Staat等[4]首次在临床上证实了IPostC的心肌保护性，使其临床应用价值得到了提高。但IPostC在应用时存在斑块破裂、血栓栓塞的风险，因此，药物后处理（PPostC）心肌保护模式显得更具有研究意义。硝酸酯是非内皮依赖性的外源性一氧化氮（NO）供体，是目前使用最为广泛的抗心肌缺血药物之一，临床上主要用于高血压、慢性稳定型心绞痛、心力衰竭等。针对硝酸酯对在体心肌IRI的影响还尚未展开研究。硝酸酯对在体心肌IRI是否具有保护作用？若有，其机制是什么？除了其扩张血管平滑肌的作用外，对心血管系统的其他作用机制目前还没有明确的定论。在现代介入及冠脉搭桥术十分普遍的情况下，越来越多的患者遭受IRI。为了使其在临床领域中显示出优越性和应用价值，在临床PCI心肌保护中发挥更重要的价值，结合目前PPostC的广阔应用前景，本实验通过建立IRI模型，与经典的IPostC相比较，旨在验证硝酸酯后处理对大鼠心肌IRI是否也有保护作用，并探讨其保护机制，从而为实现硝酸酯后处理心肌保护新模式的临床应用与推广提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级雄性Wistar大鼠32只，10～12 周龄，体质量（300±10）g，购自山东鲁抗医药股份有限公司实验动物室，合格证号：SCXK鲁20130001。

1.2 主要试剂 Evans blue（美国sigma公司），2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）（美国 sigma公司），硝酸异山梨酯（异舒吉）（珠海许瓦兹制药有限公司），Elisa试剂盒（南京建成生物工程研究所），PBS缓冲液（南京建成生物工程研究所），10%水合氯醛（青岛大学附属医院）。

1.3 主要仪器 小动物呼吸机HX-101E（成都泰盟科技有限公司），高速离心机M-802（上海手术器械厂），恒温水浴箱SHH-W21-600（北京靖卫科学仪器厂），超低温冰箱BCD-172HDA（海尔公司），电子天平（日本岛津ELB-300）（上海志荣电子科技有限公司），超净工作台JHT-DD（济南市空气净化消毒设备厂）。

1.4 心肌缺血再灌注模型的建立 大鼠10%水合氯醛腹腔麻醉，固定后连接心电图机。分离气管，接呼吸机辅助呼吸，开胸，暴露心脏，将心脏拉出胸腔，在左前降支下穿线，线的两头共同穿过一长约2 cm的硬管。提起双线头，向下压硬管，心脏表面呈暗紫色，心电图出现ST段抬高证实结扎成功。再灌注时松开硬管，缺血心肌迅速充血变红。见结扎左冠状动脉前降支前后心电图改变图（图1）。

1.5 实验分组 将实验大鼠随机分为4组。①假手术组（sham组，n=8）：只在左前降支下穿线，但不结扎，旷置220 min。②缺血/再灌注组（I/R组，n=8）：开胸结扎左前降支，造成缺血40 min；松开结扎线再灌注180 min。③缺血后处理组（IPostC组）：缺血40 min后，在恢复再灌注1 min内给予3个循环的30 s/30 s的缺血/再灌注，随后完全松开结扎线，持续再灌注180 min。④硝酸异山梨酯（异舒吉）后处理组（PPostC组）：再灌注前5 min开始，经颈动脉给予异舒吉 4 μg·kg-1·h-1，持续给药 20 min，再灌注180 min。其余三组在相同时间给予相同量的生理盐水作为对照。见实验流程图（图2）。

1.6 心肌梗死面积测定 缺血后原位结扎左前降支，从右颈动脉注入2 ml 2%Evans blue，待鼠唇蓝染后，取下心脏，生理盐水冲洗，剔除血管及左右心房、右心室，将左室（left ventricle，LV）以滤纸吸干后称重，然后置于-20℃冰箱冷冻30 min，沿心室长轴从心尖到心底部切成2 mm左右的薄片，置于1%TTC磷酸缓冲液中（pH7.4），37℃避光孵育15～20 min。孵育过程中不断摇动染液，使之与心肌组织充分接触。染色后，用生理盐水冲掉多余染液，将心脏薄片置入10%甲醛溶液固定24 h。梗死区（infarct size，IS）心肌呈灰白色，危险区（area at risk，AAR）心肌呈深红色[5]。显微镜下分离梗死区和危险区，分别置于电子天平上称重。缺血区面积=（AAR/LV）×100%。梗死区面积=（IS/AAR）×100%。见心肌染色图（图3）。

1.7 血清cTnI、SOD、MDA检测 采用 Elisa方法检测大鼠血清cTnI、SOD、MDA的含量。

1.8 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件进行分析。所有数据以±s表示，多组均数及组间两两比较分别采用单因素方差分析和最小显著差异法（LSD法）。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同处理方式对大鼠心肌梗死面积的影响Sham组只穿线不结扎，故心肌梗死面积为0；IPostC组和PPostC组缺血区面积与I/R组相比［（45.388±6.758）%、（43.498±4.327）%比 （47.117±1.821）%］，差异无统计学意义（P＞0.05），说明造模手法稳定，因而在此基础上所得梗死面积结果具有可比性。IPostC组及PPostC组与I/R组相比，心肌梗 死 面 积 减 小 ［（41.015±1.037）% 、（38.129±0.726）%比（52.190±1.216）%］，差异有统计学意义（P＜0.05）；而IPostC组与PPostC组之间未见统计学差异（P=0.057）。见表1。

表1 各组大鼠心肌缺血面积和梗死面积比较（±s）

表1 各组大鼠心肌缺血面积和梗死面积比较（±s）

注：LV：左室；AAR/LV：缺血区面积；IS/AAR：梗死区面积。与 I/R组相比，aP＜0.05

组别 LV（g） AAR/LV（%） IS/AAR（%）I/R 组 0.815±0.022 47.117±1.821 52.190±1.216 IPostC 组 0.794±0.061 45.388±6.758 41.015±1.037aPPostC 组 0.814±0.011 43.498±4.327 38.129±0.726a

2.2 不同处理方式对大鼠血清MDA、SOD、cTnI的影响 再灌注末，I/R组、IPostC组及PPostC组血清MDA水平与sham组相比显著升高［（1.81±0.03）nmol/L、（1.62 ±0.03）nmol/L、（1.59 ±0.03）nmol/L比 （1.31±0.04）nmol/L。与 I/R 组相比，IPostC 和PPostC组MDA水平有效降低（P＜0.05）。与sham组相比，I/R组、IPostC组及PPostC组血清SOD水平显著降低（P＜0.05）；但与I/R组相比，IPostC及PPostC组血清SOD水平显著升高（P＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠血清SOD、MDA 和 cTnI水平比较（±s）

表2 各组大鼠血清SOD、MDA 和 cTnI水平比较（±s）

注：SOD：超氧化物歧化酶；MDA：丙二醛；cTnI：肌钙蛋白I。与sham组相比，aP＜0.05；与 I/R 组相比，bP＜0.05

组别SOD（U/L）MDA（nmol/L）cTnI（ng/L）Sham 组 1.816±0.028 1.31±0.04 1.992 558±0.000250 I/R 组 1.794±0.019a 1.81±0.03a 1.996 793±0.000142aIPostC 组 1.811±0.001ab 1.62±0.03ab 1.995 089±0.000102abPPostC 组 1.813±0.014ab 1.59±0.03ab 1.995 252±0.000143ab

3 讨论

急性心肌梗死（AMI）是缺血性心脏病中最凶险的一种，发病率高、致死致残率高、预后差，是缺血性心脏病死亡的主要原因[6]。虽然静脉溶栓、PCI、冠状动脉旁路移植术（coronary artery bypass grafting，CABG）等方法对恢复心肌供血、挽救心肌起到了重要的作用，但同时也使心肌遭受IRI，减弱了再灌注治疗带来的疗效，因此，防治IRI是近年来心脏病领域研究的热点。在再灌注开始的前几分钟内，活性氧自由基（reactive oxide species，ROS）的生成过多是缺血/再灌注损伤发病机制的重要环节。Yang等[7]观察到，再灌注开始1 min内即有大量ROS的爆发产生，4～5 min达到高峰。Zhao等[3]和Kloner等[8]证实，缺血的心肌和血管内皮细胞在长达3 h的再灌注中ROS增多。另外，炎症反应、微循环障碍等在再灌注损伤中也扮演着重要的角色，但ROS是最主要的始动因素。因此，把握再灌注开始几分钟内的有效时间窗、清除再灌注时生成的大量自由基、减轻ROS的细胞毒性损伤对再灌注心肌保护具有重要意义[9,10]。

IPostC的提出为防治IRI开辟了一条新的道路。大部分临床试验证实，在急性心肌梗死患者行PCI手术时实施IPostC可以减轻再灌注损伤，改善预后[11-13]。但IPostC也是一项有创性操作，还存在潜在危险，比如气囊的反复充、放气，可能引起冠状动脉斑块破裂，以致发生再狭窄或血栓栓塞事件，也限制了其在临床上的推广与应用。PPostC是在心肌IPostC的基础上发展起来的，通过药物激发或模拟机体自身的内源性保护物质或直接激活相关信号通路而呈现的心肌保护作用，它以药物替代反复缺血刺激，克服了手术缺血损伤的弊端，为心肌保护开创了广阔的前景。相比之下，PPostC可能为更具实际应用价值的最适策略，它可避免与心脏、血管操作有关的不良后果，从而为心脏手术和介入治疗提供更为简单、可行的心脏保护。

硝酸酯类药物是非内皮依赖性的血管扩张剂，不论内皮细胞功能和结构是否正常都能发挥明确的扩张血管平滑肌的作用。硝酸酯进入血液循环后，通过特异性的代谢酶转化为活性的NO分子，与血管平滑肌细胞膜上NO受体结合后，激活细胞内鸟苷酸环化酶，使环磷酸鸟苷浓度增加、Ca2+水平下降，引起血管平滑肌舒张。孙海燕[14]运用电化学微传感器证实，持续长时间心肌缺血后，冠脉血流中的NO含量较基础值降低。随着再灌注时间的延长，虽然NO含量逐渐上升，但仍低于基础水平；并且NO下降的幅度与大鼠心功能的抑制程度呈正相关。补充NO的前体物质L-精氨酸对缺血心肌有正性肌力作用，可增加冠脉血流量并改善左室收缩和舒张功能[15,16]。NO的心肌保护作用除了与扩血管、抗缺血作用有关之外，可能还通过与黏附分子相互作用减轻缺血再灌注时中性粒细胞引起的内皮细胞功能障碍[17]。NO还可通过抗氧化、抗凋亡、抗炎症反应等作用对细胞产生保护作用[18]。

人们从20世纪70年代开始就认识到心肌梗死面积是影响预后的重要因素，并且在一些评估AMI新疗法的临床试验中作为预测主要心血管事件的替代终点[19,20]。CTnI是心肌损伤的特异性标志物，是较CK和CK-MB更可靠、更敏感的生化检测指标，是用于鉴别心肌损伤的“金标准”[21]。故本研究将cTnI浓度变化作为观察心肌损伤的指标之一。MDA为脂质过氧化过程中的标志性产物，因此，检测MDA的活性可间接反映机体内细胞受ROS攻击、脂质过氧化的严重程度[22]。SOD是机体内主要的抗氧化剂，能清除氧自由基，保护细胞免受损伤，因此SOD对维持机体的氧化与抗氧化平衡发挥极其重要的作用，SOD水平的高低反映机体清除氧自由基的能力[23]。本实验中，我们采用心肌酶和梗死面积作为评价心肌损伤的指标，结果表明，IPostC及PPostC均可使大鼠心肌梗死面积缩小、血清cTnI水平降低。另外，我们检测了大鼠血清SOD、MDA的含量，以反映大鼠心肌氧化应激的程度。结果显示，与I/R相比，IPostC及PPostC可升高大鼠血清SOD含量、降低MDA含量。本实验中使用的硝酸酯剂量极小，尚不能产生明确的血流动力学效应。结合SOD、MDA检测结果，说明硝酸异山梨酯后处理的心肌保护性可能是通过减少活性氧的产生、增强心肌抗氧化能力实现的。以上结果共同说明，IPostC及PPostC均可减轻心肌再灌注损伤，且两者的保护作用相当。综上所述，硝酸异山梨酯后处理可以缩小心肌梗死面积和减少心肌酶的释放，故硝酸异山梨酯后处理对心肌IRI具有保护作用。硝酸异山梨酯的心肌保护作用机制可能与减少活性氧的产生及提高心肌的抗氧化能力有关。

本实验也存在局限性。首先，何种剂量的硝酸异山梨酯既能产生心肌保护作用又不至于造成严重的氧化应激尚需进一步讨论。由于本实验例数较少，未设置不同剂量组进行比较，不能明确保护效果最佳的剂量。其次，本实验选用的大鼠均为成年健康大鼠，硝酸异山梨酯后处理在老年大鼠中的心肌保护性如何也不清楚。临床上，大部分的心肌梗死患者为老年人，同时合并多种疾病，服用多种药物。疾病状态以及其他药物对硝酸异山梨酯后处理有无影响也不得而知。再其次，硝酸异山梨酯后处理对心功能的远期影响也待阐明。同时，将实验结果应用于临床，还需考虑不同缺血时间、侧支循环、性别等，这些都是非常关键、值得深入研究的内容。以后可以就上述几个问题进一步研究硝酸异山梨酯的心肌保护作用及其机制。

（本文图片见后插二）

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Cardioprotective effect of isosorbide dinitrate postconditioning against rat myocardial ischemia-reperfusion injury in vivo

LIU Pan＊，HU Meng-fen，ZHAO Xin-wen，et al.＊Geriatric Medicine，Dalian Medical University，Qingdao Municipal Hospital，Dalian 116000，China

SONG Da-lin，E-mail：billy_mei@126.com

Objective To investigate the cardioprotective effect of isosorbide dinitrate（ISDN）postconditioning against rat myocardial ischemia-reperfusion injury in vivo and provide a theoretical basis for the application of the new mode of nitrates postconditioning in clinic.Methods A rat of heart ischemia-reperfusion injury was established.32 male Wistar rats，SPF，10-12 weeks，were randomly divided into four groups as follows:the sham group；the ischemia/reperfusion group（I/R group）；ischemic postconditioning group（IPostC group）；ISDN group（PPostC group）.Infarct size was measured at the end of experiment and the levels of serum of cTnI，MDA and SOD were detected by Elisa.Results ⑴There were no significant differences of ischemic sizes between different groups.The myocardial infarct size in IPostC group and PPostC group were significantly decreased compared with I/R group（P＜0.05），（41.015±1.037）%，（38.129±0.726），（52.190±1.216）%respectively；and there was no significant difference between IPostC group and PPostC group（P=0.057）.⑵Compared with sham group，the levels of cTnI in I/R group，IPostC group and PPostC group were significantly increased （P＜0.05）.Compared with I/R group，the levels of cTnI in IPostC group and PPostC group were significantly decreased（P＜0.05）.However，therewas no significant difference between IPostC group and PPostC group.⑶Compared with sham group，the levels of MDA in I/R group，IPostC group and PPostC group were significantly increased；the levels of SOD were significantly decreased（P＜0.05）.Compared with I/R group，IPostC and PPostC could decrease the level of MDA effectively and increase the level of SOD（both P＜0.05）.Conclusion ⑴Ischemic postconditioning can relieve the ischemia-reperfusion injury.⑵ISDN postconditioning can induce the similar cardioprotective effect as IPostC.⑶The potential mechanisms of cardioprotection of ISDN postconditioning may relate to the improvement of myocardial antioxidant capacity and reduction of the generation of reactive oxygen species.

Ischemia/reperfusion injury； Ischemic postconditioning； Cardioprotection； Isosorbide dinitrate

中国医师协会探索心血管研究基金（项目编号：DFCMDA201303）

作者单位：116000 辽宁省大连市，大连医科大学；青岛市市立医院老年内科（刘盼、柳雯、宋达琳），急诊科（赵新闻）滨州医学院附属医院老年内科（胡孟芬）

宋达琳，E-mail：billy_mei@126.com

10.3969/j.issn.1672－5301.2017.09.023

Q95-33；R542.2

A

1672-5301（2017）09-0858-05

2017-04-05）