侯文思，李玉洁，王媛媛，陶 虎

(1.西北农林科技大学 理学院，陕西杨凌 712100；2.西北农林科技大学 生命科学学院，陕西杨凌 712100)

东方粘虫中肠V-ATP酶A亚基突变体TSCA的原核表达及复性纯化

侯文思1，李玉洁1，王媛媛2，陶 虎1

(1.西北农林科技大学 理学院，陕西杨凌 712100；2.西北农林科技大学 生命科学学院，陕西杨凌 712100)

根据得到的东方粘虫[Mythimnaseparate(Walker)]中肠V-ATPase A亚基(VHA-A)基因(VATPA)，预测其三维结构，构建定点突变并复性。利用Swiss-Model在线预测VHA-A三维结构，确定突变位点，通过重折叠PCR(Overlap-PCR)技术构建突变基因并将其整合到pET-22b(+)载体上，得到重组质粒pET-22b(+)-TSCA，转入大肠杆菌BL21中表达，最后通过亲和层析纯化包涵体蛋白质并进行透析复性。结果表明，成功构建突变基因和融合表达载体，融合蛋白质以包涵体形式表达，并得到大量纯化的可溶性蛋白。

V-ATP酶A亚基；定点突变；原核表达；包涵体复性

液泡型ATP酶(V-ATPase)是由14个不同亚基组成的复合体，作为持家基因广泛分布于细胞膜系统中[1]。V-ATPase利用水解ATP释放能量将H+转运到囊泡或胞外，从而维持胞质pH的平衡，形成跨膜电化学势梯度，为细胞活动的正常进行及各种离子和代谢物的转运提供必不可少的条件[2]。在昆虫中肠，V-ATPase存在于上皮杯状柱细胞，是唯一的离子运输启动器，严格调控昆虫中肠的离子运输[3]。V-ATPase的缺失会导致昆虫出现病理变化甚至死亡[4]。近年来越来越多的学者将V-ATP酶作为药物靶标来研究[5]。已有学者利用Western杂交和质谱等方法鉴定出多种昆虫中肠的V-ATP酶A亚基可以和苏云金芽孢杆菌[Bacillusthuringiensis(Bt)]毒素结合。徐丽……