吴成斯 徐仁伵

(南昌大学第一附属医院，江西 南昌 330006)

·综述·

DNA甲基化在肌萎缩侧索硬化发病机制中的研究进展

吴成斯 徐仁伵

(南昌大学第一附属医院，江西 南昌 330006)

肌萎缩侧索硬化；表观遗传学；DNA甲基化

肌萎缩侧索硬化(ALS)是一种进行性、复杂性神经系统变性病，确切机制不明。ALS 发病人群中5%～10%为家族性ALS，大多数为散发性病例。家族性青年型ALS 遗传方式为常染色体显性或隐性遗传，成年型为常染色体显性遗传，但可有外显不全现象；部分家系中不同的ALS 患者显示有不完全同型的发病年龄及临床表型〔1〕。这说明遗传因素在ALS 发病中起了一定作用，但遗传因素并不能诠释所有的ALS。近年研究表明，除了免疫因素、慢病毒感染、中毒因素等外，环境因素在ALS 的发病中也起了重要作用〔2〕。然而目前发现由单纯的基因序列变异或环境毒物暴露所致的ALS 是极少的。因此，ALS 作为一种复杂性疾病，遗传因素与环境因素在其发生发展过程中均起了重要作用。但共同的作用机制尚不明确，而表观遗传学可能是遗传和环境因素相互作用的桥梁〔3〕。

表观遗传学(Epigenetics)是在不涉及 DNA 序列改变的情况下，通过基因组DNA 和组蛋白的化学修饰、RNA干扰、蛋白质与蛋白质相互作用、DNA 和其他分子的相互作用等影响来调节基因的功能和特征，并能遗传给后代。在一项关于双胞胎的不一致研究中发现，即使作为一对同卵双生型双胞胎，两者的表观遗传特征也存在差异。Fraga等〔4〕发现，拥有相同基因型的双胞胎在一些神经变性疾病中会表现出不同的外显率。表观遗传修饰逐渐被认为是导致很多复杂性疾病的机制之一〔5〕。在表观遗传修饰的各种类型中，DNA甲基化是最重要的发现，并被广泛研究。DNA甲基化的异常被认为参与了很多人类疾病的发病，包括肿瘤和神经变性疾病。近来，大量数据指出DNA甲基化与神经变性疾病之间存在非孟德尔遗传规律的共同特点。本文就DNA甲基化在ALS发病机制中的研究做一综述，首先概述DNA甲基化的概念，然后主要阐述近年来DNA甲基化在ALS发病机制中的研究。探讨DNA甲基化与ALS发病的相关性，从而进一步了解DNA甲基化在ALS发生的中原因及作用机制。

1 DNA甲基化

作为表观遗传学最为重要的机制之一，DNA甲基化几乎特有地发生在胞嘧啶碱基上。甲基基团常常被转移到位于胞嘧啶的5位碳原子上。被甲基化的胞嘧啶常位于基因序列中5′→3′方向紧随相连的CG碱基中，这一特定二核苷酸被记为CpG，富含CpG的区域被称为CpG岛。在人类和其他哺乳动物中，CpG岛常位于转录调控区附近，即5′端结构基因启动子的核心序列和转录起始点。基因沉默往往与这一区域的甲基化相关。在启动子区域，5-甲基胞嘧啶(5mC)修饰使得染色质重组，通过结合转录因子或提供转录抑制因子结合位点的相互作用，实现与基因表达沉默相关的调节〔6〕。而内含子区5mC修饰常常导致基因激活〔7〕。

大部分时候CpG岛并不被甲基化，除了特殊功能外，如X染色体的失活才有CpG岛的甲基化。相反，位于重复序列或丝粒序列中非CpG岛序列的CpG二核苷酸往往容易发生甲基化〔8〕。基因组中的非甲基化区域往往通过高浓度的CpG聚集和组蛋白的修饰避免甲基化〔9〕。

另外，启动子和内含子中的CpG甲基化已被广泛研究，近来越来越多的学者对非CpG序列的甲基化感兴趣，它包括CA、CT或CC(非CpG)二核苷酸中的胞嘧啶甲基化。但是CpG甲基化可以发生在细胞任何时期的基因沉默，而非CpG的甲基化主要出现在胚胎干细胞和神经生长发育中〔10〕。DNA甲基转移酶(DNMT)催化S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，将甲基基团转移至胞嘧啶上。DNMT有五种：DNMT1、DNMT2、DNMT3a、DNMT3b和DNMT3L〔11〕。根据不同DNMT在DNA甲基化中的作用方式不同，可分为持续性甲基化和从头甲基化两种模式。DNMT1即参与了持续性甲基化，在DNA复制过程中，DNMT1根据亲链上特异的甲基化位点，在子链相应位置上进行甲基化修饰。DNMT3a和DNMT3b参与DNA甲基化的从头合成，对未甲基化的DNA中CpG位点进行甲基化。DNMT3L是一种相关蛋白调节因子，本身不具有DNA甲基化功能，但可调节DNMT3a和DNMT3b的活性。DNMT2可催化38-胞嘧啶的天门冬氨酸转运RNA的反密码子环，使其甲基化。

除了5mC之外，还存在另一种甲基化胞嘧啶，即5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)。5hmC最早于1972年首次在哺乳动物DNA中被发现，是10-11易位蛋白(TET)家族的酶通过氧化5mC产生的。5hmC也可通过活化诱导脱氨酶/载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽家族(AID/APOBEC)介导分解为5mC〔12〕。2009年，有两个研究团队分别同时报道5hmC在小鼠大脑及胚胎干细胞中有着丰富表达，羟甲基化的概念才又一次进入人们的视野并得到重视。5hmC被认为可能也是一个重要的表观遗传学标记，可能影响转录调控，或在参与去甲基化过程中与基因激活相关〔13〕。因此，DNA甲基化具备对基因表达调控的有效分子途径，甲基化的相对稳定、易检测和可逆性，也使其下一步更可能成为表观遗传学的分子标记物和治疗靶点。

DNA甲基化与组蛋白乙酰化共同作用可调控记忆的形成和突触的可塑性〔14〕。并且可能对控制行为的基因和神经功能造成影响〔15〕。除此之外，最近几年已有大量的研究发现DNA甲基化、染色质结构和基因沉默之间的关系，并且认为基因沉默是神经变性疾病(如阿尔茨海默病)的表观遗传学发病机制之一〔16〕。因此，我们也推测DNA甲基化与神经变性疾病ALS亦有可能的相关性。

2 DNA甲基化与ALS发病的相关性

ALS是一种侵犯运动系统的原发性、致命性神经变性疾病，临床显著特征是同时出现脑干和脊髓的下运动神经元，以及运动皮质的上运动神经元损害体征。这些神经元的丢失会导致以下临床症状：肌萎缩、肌无力、肌束震颤、肌肉痉挛和认知功能障碍〔17〕。目前认为与ALS发病相关的机制包括氧化应激、兴奋性氨基酸的毒性作用、轴突运输的受损、神经生长因子的缺乏、神经炎症反应、凋亡以及蛋白质转换的改变等等，并且，还发现星形胶质细胞和小胶质细胞对运动神经元微环境的影响也是ALS发病的原因之一〔18〕。无论遗传还是环境因素，都不能单一地解释ALS的发病。所以，与其他神经变性疾病一样，DNA甲基化可能通过基因和环境的多因素潜在地影响着ALS的发病。

2.1DNA甲基化对ALS遗传因素的影响

2.1.1ALS发病相关的遗传机制 ALS分为家族性ALS(FALS)和散发性ALS(SALS)两大类，FALS多为常染色体显性遗传，X染色或隐性遗传少见。目前已发现一些与ALS发病相关的基因突变，其中，20%FALS发病与超氧化物歧化酶-1(SOD1)突变相关。编码TAR DNA连接蛋白基因(TARDBP)有超过40种不同的错义突变与FALS相关〔19〕。少于5%的FALS与RNA连接蛋白肉瘤融合基因(FUS)突变相关。C9orf72基因位点是ALS和额颞叶痴呆(FTD)最常见的基因突变。UBQLN2的突变导致X连锁的TAR DNA结合蛋白-43(TDP-43)阳性的FTD或ALS。MATR3也被认为与ALS发病相关。SETX基因的突变也在ALS与进行性运动神经病变患者中发现。ALS和FTD还被发现与CHCHD10基因突变相关。其它相关基因还有：GRN、ANG、CHMP2B、PEN1、OPTN、VCP等。与SALS发病相关的基因，有编码组蛋白乙酰转移酶(HAT)的复合延伸蛋白基因(ELP3)〔20〕、ALS2和ATXN2〔21〕。

2.1.2DNA甲基化在ALS遗传因素中的研究进展 首先，在ALS患者的大脑和脊髓中发现存在DNMT3a，它可使DNA甲基化具有可逆性，在体外实验中也发现DNMT3a的过度表达会促进类似运动神经元的细胞死亡〔22〕。ALS患者的血液和神经组织中也显示全基因组甲基化和羟甲基化增多〔23〕，并找到ALS患者大脑和脊髓组织中基因甲基化的位点〔24〕。全基因组甲基化测序显示与ALS发病相关的OPTN基因(编码视神经蛋白的基因，optineurin)呈现出低甲基化。

其次，与ALS相关的C9orf72基因，发现其中的碱基重复扩增与CpG岛的超甲基化相关。在ALS患者的组织样本中发现，C9orf72基因CpG岛超甲基化与重复扩增序列出现呈相关性〔25〕。FTD患者的血液标本检测，携带C9orf72基因扩增的患者相比未携带者，甲基化水平明显升高〔26〕。但C9orf72启动子的超甲基化被推测可阻止与碱基重复扩增相关的异常损害。在人淋巴细胞系中发现，启动子的超甲基化导致C9orf72基因的转录沉默，但去甲基化却逆转了它的保护性作用〔27〕。DNA甲基化的修饰在其他核苷酸重复扩增序列的神经变性疾病中也出现，如脊髓小脑性共济失调1型、遗传性共济失调、X染色体易损综合征、肌强直性营养不良、帕金森病和阿尔茨海默病〔22，25，28，29〕。这些证据都支持一个论点，即DNA甲基化的修饰可能参与了ALS患者神经元的变性。见表1。

在大鼠模型中，运动神经元凋亡的过程中DNMT1、DNMT3a和5mC的变化与人类ALS的相类似，说明DNMT通过DNA甲基化可能介导了神经元细胞的死亡。另外，人类ATXN2(编码一种多谷氨酰胺(polyQ)蛋白)基因启动子的CpG甲基化与脊髓小脑共济失调2型(SCA2)中CAG异常扩增相关〔30〕。ATXN2基因中这一异常的扩 增被证实会导致ALS发生〔31〕，因此，我们推断ATXN2启动子的甲基化可能与ALS的发病存在关联。

另外，也存在着一些相反结果的研究。SOD1和VEGF(编码血管内皮生长因子的基因，控制血管生长的信号分子)的表观遗传学研究发现，在ALS患者中，这些基因的启动子区域大部分为未甲基化的，表明通过DNA甲基化而实现的转录沉默并不是这一类ALS的常见发病机制〔32〕。见表2。

研究发现人类谷氨酸转运蛋白EAAT2(在鼠类称为GLT-1)基因启动子的甲基化与该基因沉默状态相关，并且EAAT2转运蛋白的功能障碍可能导致了ALS的发病〔33〕。因此，在ALS模型中进一步证实，是否通过DNA甲基化表观遗传学机制来调节EAAT2转运蛋白功能的机制是十分有意义的。在大鼠星形胶质细胞中，GLT1启动子的CpG岛特异性超甲基化被证实参与了GLT1启动子功能的抑制。但在EAAT2基因异常的ALS患者中，这一抑制作用被证实并未导致星形胶质细胞的功能障碍〔34〕。正是因为上述研究结果的互相矛盾，需要收集更权威和更令人信服的证据以证实DNA甲基化通过调控EAAT2的表达而参与了ALS的发病。

表1 可能参与ALS神经元变性的甲基化修饰位点

表2 与ALS发病相关基因的特异性位点甲基化情况

2.2DNA甲基化对环境因素的影响 尽管已发现ALS的发病有明显的遗传易感性，但仍有许多发病原因归于环境因素〔35〕，SALS被发现与以下因素相关，如有毒物质的接触、饮食、炎性细胞因子、获得性基因突变等。这些因素很可能都参与到由表观遗传学修饰所介导的分子机制中。

暴露于重金属被证实与SALS相关，对重金属解毒功能的受损会导致SALS的明显易感性。金属硫蛋白是一类对重金属起主要解毒作用的蛋白家族。事实上，在任何一例SALS患者或对照组中，未发现人类金属硫蛋白基因启动子的甲基化，说明这一基因启动子的甲基化可能并不是SALS的常见病因〔36〕。然而，在一些病例的海马细胞中发现ALS2基因启动子的甲基化程度发生改变，其中更高水平的启动子甲基化被证实与ALS转录抑制相关，而他们在儿童时期均有过受虐病史〔37〕。说明DNA甲基化参与了ALS基因的调控过程。

3 结语与展望

上述大量研究阐述了DNA甲基化与ALS的相关性。通过对表观遗传学的研究，也对它提出了新的定义理解，认为它是一种染色质结构在适应各种状态时随之改变的机制〔38〕。

它参与整合神经元的发生发展、可塑性以及老化过程，可应对除遗传因素之外的其它刺激，使细胞维持稳态〔6〕。但作为一个新兴领域，表观遗传学、DNA甲基化还有许多未完全明确的问题。DNA甲基化作为ALS发病的原因之一也提示了我们一种新的治疗途径。同时，因为在大脑不同区域里的不同细胞中DNA甲基化模式不同〔39〕，所以要明确DNA甲基化在ALS发病中确切机制，还需要更大样本量更多时间观察点的进一步研究。

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〔2016-11-13修回〕

(编辑 袁左鸣)

江西省自然科学青年基金项目(20161BAB215233)

徐仁伵(1969-)，男，博士生导师，主要从事神经变性疾病研究。

吴成斯(1984-)，女，讲师，主要从事神经变性疾病研究。

R746.4

A

1005-9202(2017)16-4147-05；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.16.107