刘 欣 毛大华

(贵州医科大学，贵州 贵阳 550025)

Ki-67在Luminal 型乳腺癌患者中的表达水平及其与临床病理特征的关系

刘 欣 毛大华1

(贵州医科大学，贵州 贵阳 550025)

目的探讨Ki-67在Luminal 型乳腺癌患者中的表达水平与临床病理的关系。方法选取2012年8月至2014年8月该院62例乳腺癌患者为研究组，并选取同期来该院体检的30例乳腺增生患者为对照组，采用实时荧光定量RT-PCR法检测两组组织及血清中Ki-67的表达，探讨Ki-67与临床病理的相互关系，并通过低表达人乳腺癌细胞系MCF-7中Ki-67后观察细胞的增殖与迁移能力。结果与对照组比较，乳腺癌患者血清及组织中Ki-67的表达水平均显著增加(均P<0.05)。Ki-67的mRNA水平在乳腺癌癌组织中的表达水平亦显著高于对照组(P<0.05)；相关分析结果显示，Ki-67的高表达与乳腺癌的临床分期、肿瘤大小及淋巴结转移呈显著正相关(均P<0.05)。低表达Ki-67后人乳腺癌细胞系MCF-7中乳腺癌细胞的增殖水平显著降低，迁移能力显著减少(均P<0.05)。结论乳腺癌患者体内增加的Ki-67水平可能对乳腺癌的发生发展有着一定的促进作用，其机制可能是通过影响癌细胞的增殖和迁移水平来发挥作用。

Ki-67；乳腺癌；增殖；迁移

目前临床上将乳腺癌主要分为：Luminal型(激素受体表达肿瘤)、人表皮生长因子受体(HER)2阴型(激素受体阴性)及基底样型(缺少激素受体及HER2表达)。其中，激素受体阳性型可进一步分为Luminal A型和Luminal B型。在肿瘤发生的病理生理过程中，肿瘤细胞的异常性增殖以及过度迁移是其中最为关键的部分。Ki-67 是一种与增殖细胞相关的核抗原，其可表达于除G0期外的所有细胞周期阶段，是近年来认为能够有效判断细胞增殖活性指数的分子指标〔1〕。研究认为，Ki-67增殖活性高低和乳腺癌的分化程度、浸润转移及预后有一定的关系〔2〕，但具体的作用机制尚未明了。本研究旨在分析Ki-67与乳腺癌患者临床病理特征之间的关系，并通过低表达人乳腺癌细胞系MCF-7中Ki-67后观察肿瘤细胞的增殖与迁移能力，探讨Ki-67影响乳腺癌的分子机制。

1 资料与方法

1.1临床资料 所有组织来源于2012年8月至2014年8月贵州医科大学附属乌当医院收治的62例Luminal 型乳腺癌患者。其中Luminal A型28例，Luminal B型34例。患者均为女性，年龄22～57〔平均(43.5±9.2)〕岁，术前未经放、化疗治疗。于同期随机选取的30例乳腺增生患者为对照组，年龄24～54〔平均(45.5±11.4)〕岁。本研究根据雌激素受体(ER)和(或)孕激素受体(PR)表达与否，Luminal 型乳腺癌患者的诊断标准：Luminal A型ER(+)和(或)PR(+)且HER-2(-)；Luminal B型ER(+)和(或)PR(+)且HER-2(+)。 两组性别、年龄等一般情况无显著差异(均P>0.05)，具有可比性。患者均知情同意。

1.2主要试剂 组织、血清中的RNA通过Trizol试剂盒(Life Technologies)提取；RNA逆转录通过cDNA逆转录试剂盒(美国PROMEGA公司)进行；PCR试剂盒(南京生兴生化科技有限公司)。

1.3逆转录反应 清晨空腹时抽取两组外周静脉血5 ml，尽快于4℃下4 000 r/min离心5 min。离心后提取上层血清放入-80℃保存备用。研究者于手术中取乳腺癌患者及增生患者组织200 mg进行试验，在组织中加入1 ml 的Trizol并充分匀浆，并抽提总RNA，并将其溶于30 μl的焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水，采用紫外分光光度计对提取的总RNA进行定量。同时，将获得的RNA逆转录成cDNA，置于-20℃环境下保存留待后用。Ki-67的引物序列参考文献〔3〕。U6为对照内参。PCR反应条件：95℃变性20 s，60℃ 20 s和70℃ 1 s 50个循环。采用7300型Real-Time PCR仪器(美国ABI公司)进行PCR分析，并以2-ΔΔCt法进行相对定量分析〔4〕，最终结果以相对于对照组的倍数进行描述。

1.4免疫组化及判定标准 取乳腺癌组织标本以10%甲醛固定48 h后，石蜡包埋切片为4 μm切片，用Ki-67抗体(北京中山生物技术有限公司)进行常规S-P免疫组化染色，以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照，光学显微镜观察棕色的阳性群。细胞核上的棕褐色颗粒计为Ki-67 阳性。参照肿瘤细胞的染色程度和染色反应强度评估免疫组化的染色结果。在高倍视野(蔡司Stemi DV4，×100)下随机选取 10 个不同的视野进行统计：阳性细胞数<5%为阴性，5%～25%为+：26%～50%为，51%～75%为。阳性率=阳性细胞数/10个视野的细胞数×100%。

1.5细胞转染 MCF-7细胞(上海研晶生物科技有限公司)采用完全DMEM培养液培养：含不完全DMEM(美国Gibco)10%胎牛血清(美国Gibco)及1%的青链霉素(武汉博士德)，以37℃，5% CO2下培养。取对数生长期人乳腺癌细胞系MCF-7细胞，采用脂质体LipofectamineTM2000(上海英骏)对MCF-7中Ki-67进行小RNA干扰，Ki-67的siRNA序列为5′-CCACCAGAGCCAAUAGAUACUUCAG-3′及5′-CUGAAGUAUCUAUUGGCUCUGGUGGUG-3'；对照序列为5′-UCAUAAGUGAUGCUGGAGCTT-3'。用RT-PCR技术验证转染效率。

1.6细胞侵袭实验 调整细胞密度至(3～5)×105个/ml，按0.1 ml/孔加入到transwell小室的上层，小室下层加入1 ml 10%血清的培养液。培养24 h时间后，取出transwell小室，吸去上层的培养基，终止实验，使小室于室温下自然干燥。无水乙醇固定后，采用0.1%结晶紫于室温下染色30 min，倒置显微镜(蔡司Axio Observer A1m)下观察己迁移至小室下层的细胞。随机选取5个视野后计数小室下层的细胞数目。

1.7细胞增殖实验 MCF-7细胞转染siRNA 对照序列及siRNA Ki-67干扰序列后的0、24、48、72 h每孔按1∶10体积比混合无血清必需基本培养基 DMEM 和胆囊收缩素(CCK)-8(Cell signaling)，采用分光光度计于450 nm波长(上海美谱达，型号 UV-3100)测定每孔OD值，并制作细胞生长曲线，本实验每样5复孔，重复3次。

1.8统计学方法 应用SPSS17.0软件进行t、χ2检验、秩和检验和Spearman分析法。

2 结 果

2.1乳腺癌患者血清及组织中Ki-67蛋白水平比较 Ki-67在乳腺癌患者血清组织中的mRNA表达水平(3.18±0.62，3.61±0.54)显著高于对照组(1.05±0.14，1.04±0.11)(t=25.729，36.104；均P=0.000)。

2.2Ki-67在不同组织病理型乳腺癌中的表达 参照 AJCC乳腺癌TNM分期，Ⅰ期 11例，Ⅱ期20 例，Ⅲ期31例；Spearman 相关分析结果显示乳腺癌组织Ki-67表达强度与TNM分期、肿瘤大小、淋巴结转移个数呈正相关 (P<0.05)。见表1。

2.3低表达水平与乳腺癌细胞增殖及侵袭的影响 MCF-7细胞低表达48 h后，MCF-7细胞中Ki-67 mRNA表达水平显著降低；此外，低表达Ki-67的乳腺癌细胞的增殖水平显著增加，48 h及72 h时的组间差异有统计学意义(P<0.05)；低表达Ki-67的乳腺癌细胞的迁移能力减少(P<0.05)。见表2。

表1 Ki-67表达与乳腺癌TNM分期、肿瘤大小及淋巴结转移的关系(n)

1)有2例无淋巴结转移

表2 低表达水平与乳腺癌细胞增殖及侵袭的影响(±s,n=5)

与Blank组比较：1)P<0.05，与Control组比较：2)P<0.05；与0 h时点比较：3)P<0.05

3 讨 论

乳腺癌在我国的某些地区发病率已上升为女性恶性肿瘤的第一位，乳腺癌的发病率呈逐年增加，并且有年龄年轻化的趋势。恶性肿瘤最为重要的生物学特性为侵袭转移，同时也是引起乳腺癌患者死亡的主要原因〔4〕，然而，其具体的致病过程和病理学机制尚不完全清楚。研究表明，Ki-67是一种定位于第 10 号染色体上的基因，可以识别增殖细胞核基质内的核蛋白，起作用主要与细胞的有丝分裂密切关联，尤其与肿瘤细胞的增殖息息相关〔4～6〕。然而，关于Ki-67与Luminal 型乳腺癌之间的关系，其在乳腺癌发病机制中的作用，目前相关的研究相对较少。

本研究结果提示Ki-67可能与乳腺癌的发生、发展密切相关。Warth等〔7〕在非小细胞肺癌患者体内发现Ki-67表达水平增加，并且可以作为预测指标；Pollack等〔8〕和Khor等〔9〕在前列腺癌患者体内亦发现Ki-67表达显著增加；此外，Inwald等〔10〕在乳腺癌患者体内发现Ki-67表达显著增加，并且可以作为预测乳腺癌发病的指标。本研究结果提示Ki-67的高表达参与了乳腺癌的发生发展过程，进一步说明Ki-67在乳腺癌组织中发挥重要的促进肿瘤形成及转移的作用。研究还发现，低表达膀胱癌细胞中Ki-67水平后能够抑制肿瘤的生长〔11〕。本研究结果说明了Ki-67可能影响通过调节癌细胞的增殖水平影响着乳腺癌患者体内癌细胞的恶性程度。

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7Warth A，Cortis J，Soltermann A，etal.Tumour cell proliferation(Ki-67)in non-small cell lung cancer：a critical reappraisal of its prognostic role〔J〕.Br J Cancer，2014；111(6)：1222-9.

8Pollack A，DeSilvio M，Khor LY，etal.Ki-67 staining is a strong predictor of distant metastasis and mortality for men with prostate cancer treated with radiotherapy plus androgen deprivation：Radiation Therapy Oncology Group Trial 92-02〔J〕.J Clin Oncol，2004；22(11)：2133-40.

9Khor LY，Bae K，Paulus R，etal.MDM2 and Ki-67 predict for distant metastasis and mortality in men treated with radiotherapy and androgen deprivation for prostate cancer：RTOG 92-02〔J〕.J Clin Oncol，2009；27(19)：3177-84.

10Inwald EC，Klinkhammer-Schalke M，Hofstadter F，etal.Ki-67 is a prognostic parameter in breast cancer patients：results of a large population-based cohort of a cancer registry〔J〕.Breast Cancer Res Treat，2013；139(2)：539-52.

11Pichu S，Krishnamoorthy S，Shishkov A，etal.Knockdown of Ki-67 by dicer-substrate small interfering RNA sensitizes bladder cancer cells to curcumin-induced tumor inhibition〔J〕.PLoS One，2012；7(11)：e48567.

〔2016-10-11修回〕

(编辑 袁左鸣/滕欣航)

毛大华(1964-)，男，副主任医师，主要从事乳腺肿瘤研究。

刘 欣(1983-)，男，主治医师，主要从事乳腺肿瘤研究。

R73

A

1005-9202(2017)16-3954-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.16.020

1 贵州医科大学附属乌当医院乳腺外科