张 剑 肖 乐 郭晓东 侯德智 龚昆梅 欧阳一鸣

(云南省第一人民医院 昆明理工大学附属医院普外一科，云南 昆明 650034)

下肢动脉粥样硬化斑块内miRNA-199a-3p对外周血单核细胞的影响

张 剑 肖 乐 郭晓东 侯德智 龚昆梅 欧阳一鸣

(云南省第一人民医院 昆明理工大学附属医院普外一科，云南 昆明 650034)

目的探讨下肢动脉粥样硬化斑块内miRNA-199a-3p对外周血单核细胞的影响。方法选取37例下肢动脉粥样硬化闭塞症(AS)患者外周血为AS组。另外选取同期37名健康体检者外周血为对照组。新鲜血管组织取自1例下肢AS患者截肢远端血管为实验组，以其截肢近端血管为对照。实时荧光定量PCR检测新鲜血管组织，分离得到的外周血中单核细胞和微泡中miRNA-199a-3p表达水平。以人单核细胞TTHP-1为载体，miRNA-199a-3p mimics组和miRNA-199a-3p inhibitor组分别转染miRNA-199a-3p mimics和miRNA-199a-3p inhibitor，同时设置空白对照组。实时荧光定量PCR检测各组miRNA-199a-3p、趋化因子单核细胞趋化蛋白(MCP)-1、调解活化正常T细胞表达和分泌的趋化因子(RANTES)和Fractalkine表达水平。结果下肢动脉粥样硬化斑块内miRNA-199a-3p表达水平显著高于正常组织(P<0.05)。AS组外周血单核细胞和微泡中miRNA-199a-3p表达水平均显著高于对照组(P<0.05)。与空白对照组相比，miRNA-199a-3p mimics组miRNA-199a-3p表达水平显著上升(P<0.05)，miRNA-199a-3p inhibitor组miRNA-199a-3p表达水平显著下降(P<0.05)。与空白对照组相比，miRNA-199a-3p mimics组MCP-1、RANTES和Fractalkine的mRNA表达水平显著降低(P<0.05)，miRNA-199a-3p inhibitor组MCP-1、RANTES和Fractalkine的mRNA表达水平显著上升(P<0.05)。结论动脉粥样硬化斑块内巨噬细胞高表达miRNA-199a-3p，并以微泡形式分泌到外周血中，抑制单核细胞中MCP-1、RANTES和Fractalkine等趋化因子的表达，是一种动脉粥样硬化保护因素。

动脉粥样硬化；miRNA-199a-3p；单核细胞；趋化因子

下肢动脉粥样硬化闭塞症(AS)是由于动脉粥样硬化导致下肢动脉狭窄、闭塞的缺血性疾病，是全身性动脉粥样硬化的局部表现，总体发病率在3%～10%，且随着年龄的增长而增加，在70岁以上的人群中发病率上升至15%～20%〔1〕。下肢AS是一个多因素共同参与的过程〔2〕，单核-巨噬细胞对氧化低密度脂蛋白(OX-LDL)识别、吞噬和泡沫细胞形成在动脉粥样硬化过程中具有重要作用〔3〕。微泡(MV)是一类由正常或异常细胞分泌至外周血循环或周围组织液中的微小囊泡状结构的统称，根据其直径大小可以分为微粒(microparticle，直径100～1 000 nm)和外泌小体(exosome，直径30～100 nm)〔4〕。MV内部包裹着蛋白、DNA、mRNA和微小RNA(miRNA)等，其表面脂质磷脂双分子层结构上的蛋白具有抗原性并为多种受体识别。研究证实，MV与动脉粥样硬化具有密切关系，其内携带的miRNA具有调控mRNA表达的作用〔5〕。本文通过分析miRNA-199a-3p在粥样斑块中的表达水平，探讨其对外周血单核细胞向泡沫细胞转化过程的影响。

1 材料与方法

1.1标本来源 选取2016年10～12月在云南省第一人民医院收治的37例下肢AS患者外周血为AS组。入选标准：术前影像学检查示下肢动脉存在多节段、复杂病变；患者知情同意后，能够自愿配合参与调查研究。排除合并恶性肿瘤、严重肝肾功能不全者和孕妇。另外选取同期37名健康体检者外周血为对照组。新鲜血管组织取自就诊于该院的1例下肢AS患者截肢远端血管为实验组，以其截肢近端血管为对照。

1.2主要仪器及试剂 超净工作台(AIRTECH，苏净集团安泰公司)；紫外分光光度计(N2S，上海仪电分析仪器有限公司)；台式低温高速冷冻离心机(3K3，Sigma，美国)；定量 PCR 仪(ABI step one plus，美国)；普通酶标仪(DG-3022，美国)；BD Influx 流式细胞分选仪(BD公司，美国)；NanoDrop超微量分光光度仪(Thermo Fisher Scientific，美国)。

DMEM低糖培养基(GIBCO公司)；人单核细胞TTHP-1(上海哈灵生物有限公司)；miRNA荧光定量PCR检测试剂、miRNA-199a-3p特异引物试剂盒、miRNA-199a-3p mimics、miRNA-199a-3p inhibitor、miRNA 提取试剂盒(MirVana miRNA isolation Kit AMI 560 Ambion，美国)；Trizol (Invitrogen，美国)；磷酸盐缓冲液(PBS，Sigma公司，美国)；其他试剂均为国产分析纯。

1.3血管组织miRNA-199a-3p表达水平检测 采用茎环引物的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测miR-199a-3p的表达水平。取新鲜血管组织标本，提取总RNA，严格按试剂盒说明书操作。经NanoDrop超微量分光光度仪检测提取的RNA浓度及质量。miRNA-199a-3p上游引物5′-ACACCAGCTGGGTACAGTAGTCTGCACA-3′，下游引物5′-GTGTCGTGGAGTCGGCAATTC-3′。以小核RNA的U6 RNA作为内参，U6上游引物5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游引物：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。 实时荧光定量PCR反应体系：SYBR Green supermix 12.5 μl，cDNA模板2 μl，RNase Free H2O 8 μl，上、下游引物各1 μl；反应条件：95℃30 s，95℃5 s，60℃20 s，72℃20 s，共循环45次。

1.4MV中miRNA-199a-3p表达水平检测 外周血加入PBS(1∶7)稀释后，离心(100 000 r/min，2 h)，弃去上清，所得沉淀即为抽提的MV，PBS悬浮，置于-80℃冰箱保存。采用实时荧光定量PCR检测miR-199a-3p的表达水平，方法同1.3。

1.5单核细胞中miRNA-199a-3p表达水平检测 新鲜外周血中加入等量6%右旋糖酐溶液，室温静置60 min，将上层液移入另一试管中，加入无Ca2+、Mg2+的Hank液，混匀，离心(2 000 r/min，10 min)，弃上清。相同方法再洗涤2次。以CD68为单核细胞标志物，采用BD Influx 流式细胞分选仪进行分选，留取单核细胞。采用实时荧光定量PCR检测miR-199a-3p的表达水平，方法同1.3。

1.6单核细胞培养及转染过程 从液氮罐中取出人单核细胞TTHP-1冻存管，复苏后，采用含10%胎牛血清的DMEM培养基重悬，置于细胞培养箱(5%CO2、37℃)下继续培养，离心后传代或换液，维持细胞单个、圆、亮的悬浮状态。至细胞对数生长期，分为空白对照组、miRNA-199a-3p mimics组和miRNA-199a-3p inhibitor组，每组设置6个复孔，用无血清培养基稀释转染试剂分别转染FuGENE、miRNA-199a-3p mimics和miRNA-199a-3p inhibitor，静置15 min后，加入细胞培养液中，置于细胞培养箱(5% CO2、37℃)下继续培养3 d后收集细胞，提取总RNA，严格按说明书操作，经NanoDrop超微量分光光度仪检测所提取RNA浓度及质量。采用实时荧光定量PCR检测miR-199a-3p的表达水平，方法同1.3。

1.7趋化因子检测 各组单核细胞提取总RNA，逆转录为cDNA，采用实时荧光定量PCR检测趋化因子单核细胞趋化蛋白(MCP)-1、调解活化正常T细胞表达和分泌的趋化因子(RANTES)和Fractalkine。MCP-1上游引物5′-CAGCCAGATGCAATCAATGCC-3′，下游引物5′-TGGAATCCTGAACCCACTTCT-3′。RANTES上游引物5′-ATCCTCATTGCTACTGCCCTC-3′，下游引物5′-GCCATTGGTTAAGAAATACTCC-3′。 Fractalkine上游引物5′-ACCACGGTGTGACGAAATG-3′，下游引物5′-CTCCAAGATGATTGCGCGTTT-3′。 实时荧光定量PCR反应条件：95℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，共循环40次。

1.8统计学方法 应用SPSS19.0软件，计量资料行t检验，计数资料采用χ2检验。

2 结 果

2.1血管组织miRNA-199a-3p表达水平 动脉粥样硬化斑块内miRNA-199a-3p表达水平(8.51±3.03)显著高于正常组织(3.62±1.22)(P<0.05)。

2.2单核细胞和MV中miRNA-199a-3p表达水平 AS组外周血单核细胞(0.86±0.12)和MV中(6.31±1.25)miRNA-199a-3p表达水平均显著高于对照组(0.35±0.09，3.05±0.58)(P<0.05)。

2.3各组单核细胞miRNA-199a-3p表达水平 与空白对照组(1.00±0.12)相比，miRNA-199a-3p mimics组miRNA-199a-3p表达水平(1.81±0.15)显著上升(P<0.05)，miRNA-199a-3p inhibitor组miRNA-199a-3p表达水平(0.44±0.09)显著下降(P<0.05)。

2.4MCP-1、RANTES和Fractalkine的mRNA表达水平 与空白对照组相比，miRNA-199a-3p mimics组MCP-1、RANTES和Fractalkine的mRNA表达水平显著降低(P<0.05)，miRNA-199a-3p inhibitor组MCP-1、RANTES和Fractalkine的mRNA表达水平显著上升(P<0.05)。见图1。

与空白对照组比较:1)P<0.05图1 各组单核细胞MCP-1、RANTES和FractalkinemRNA表达水平

3 讨 论

下肢AS好发于大中型动脉，最易受累的部位包括小腿股腘动脉、胫腓动脉和主髂动脉，临床表现为静息痛、间歇性跛行、难治性溃疡等。

本组数据显示，动脉粥样硬化斑块内miRNA-199a-3p呈高表达状态。miRNA-199a-3p基因定位于19号染色体p13.2的DNM2基因16号内含子内，在多个肿瘤中证实存在高表达，如结直肠癌、肝癌、胃癌、膀胱癌等，可能具有促进癌细胞发生与进展的作用〔6〕。miRNA-199a-3p与动脉粥样硬化关系的研究还十分有限。本文结果显示AS组外周血单核细胞和MV中miRNA-199a-3p表达水平均显著高于对照组，由此可见动脉粥样硬化斑块内巨噬细胞表达的miRNA-199a-3p可能通过MV形式分泌入外周血，被单核细胞吞噬，从而对其造成影响，与曾庆坛等〔7〕报道一致。

本文在细胞水平通过将miRNA-199a-3p mimics和miRNA-199a-3p inhibitor转染进单核细胞，提示miRNA-199a-3p mimics和miRNA-199a-3p inhibitor成功转染，并分别上调和抑制了miRNA-199a-3p的表达水平；并且miRNA-199a-3p具有抑制单核细胞内MCP-1、RANTES和Fractalkine表达的作用。

趋化因子在动脉粥样硬化形成过程中起到至关重要的作用〔8〕。最新研究显示，血管平滑肌细胞、内皮细胞、血小板等分泌的趋化因子RANTES(CCL5/CCR5)、MCP-1 (CCL2/CCR2)和Fractalkine(CX3CL1/CX3CR1)与动脉粥样硬化斑块的形成过程具有紧密关系。RANTES属于CC趋化因子家族，主要通过结合CCR5，作用于嗜酸粒细胞、T细胞和单核细胞上，趋化其进入内皮下促进动脉粥样硬化斑块的形成〔9〕。MCP-1具有调节单核细胞黏附及迁移进入动脉壁的作用，还具有趋化和促进平滑肌细胞增殖的作用，直接或间接地参与了动脉粥样硬化斑块的形成过程〔10〕。Fractalkine属于CX3C家族趋化因子，主要与受体CX3CR1结合，从而参与动脉粥样硬化炎症反应过程〔11〕。

综上所述，动脉粥样硬化斑块内巨噬细胞高表达miRNA-199a-3p，并以MV形式分泌到外周血中，抑制单核细胞中MCP-1、RANTES和Fractalkine等趋化因子的表达，是一种动脉粥样硬化保护因素。

1邓 尧，谢明星，吕 清，等.下肢动脉粥样硬化闭塞症患者颈动脉僵硬度改变与左心室舒张功能关系的超声评价〔J〕.中华超声影像学杂志，2012；21(10)：842-5.

2廖伟光，谢治惟，陈仕章.ACEI (ARB)，辛伐他汀，阿司匹林联用早期干预下肢动脉粥样硬化血管闭塞症的临床研究〔J〕.中西医结合心脑血管病杂志，2012；10(2)：229-30.

3Van Wagner LB，Ning H，Lewis CE，etal.Associations between nonalcoholic fatty liver disease and subclinical atherosclerosis in middle-aged adults：the Coronary Artery Risk Development in Young Adults Study〔J〕.Atherosclerosis，2014；235(2)：599-605.

4Li KY，Zheng L，Wang Q，etal.Characteristics of erythrocyte-derived microvesicles and its relation with atherosclerosis〔J〕.Atherosclerosis，2016；255(6)：140-4.

5Wagner S,Schorr J,Ludwig A,etal.Contrast-enhanced MR imaging of atherosclerosis using citrate-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles：calcifying microvesicles as imaging target for plaque characterization〔J〕.Int J Nanomed，2013；8(12)：767-79.

6Tian R，Xie X，Han J，etal.miR-199a-3p negatively regulates the progression of osteosarcoma through targeting AXL〔J〕.Am J Cancer Res，2014；4(6)：738-50.

7曾庆坛，郝长宁，阚科佳，等.动脉粥样斑块内微小核糖核酸-199a 抑制单核细胞炎性反应〔J〕.中华实验外科杂志，2016；33(12)：2688-90

8Kimura S，Wang KY，Yamada S，etal.CCL22/macrophage-derived chemokine expression in apolipoprotein e-deficient mice and effects of histamine in the setting of atherosclerosis〔J〕.J Atheroscler Thromb，2014；22(6)：599-609.

9Zhong ZX，Li B，Li CR，etal.Role of chemokines in promoting instability of coronary atherosclerotic plaques and the underlying molecular mechanism〔J〕.Braz J Med Biol Res，2015；48(2)：161-6.

10Mikolajczyk TP，Nosalski R，Szczepaniak P，etal.Role of chemokine RANTES in the regulation of perivascular inflammation，T-cell accumulation，and vascular dysfunction in hypertension〔J〕.FASEB J，2016；30(5)：1987-99.

11Sindhu S，Koshy M，Al-Roub AA，etal.Differential association of plasma monocyte chemoattractant protein-1 with systemic inflammatory and airway remodeling biomarkers in type-2 diabetic patients with and without asthma〔J〕.J Diabetes Metab Disord，2016；15(1)：40.

〔2017-03-22修回〕

(编辑 袁左鸣)

EffectsofmiRNA-199a-3pinatheroscleroticplaqueonperipheralbloodmononuclearcells

ZHANGJian,XIAOLe,GUOXiao-Dong,etal.

GeneralSurgicalDepartmentoftheFirstPeople'sHospitalofYunnanProvince,KunhuaAffiliatedHospitalofKunmingUniversityofScienceandTechnology,Kunming650034,Yunnan,China

ObjectiveTo investigate the effect of miRNA-199a-3p in atherosclerotic(AS) plaque on peripheral blood mononuclear cells.MethodsTwenty patients with arterial atherosclerosis were treated as AS group. In addition, 37 healthy subjects were selected as the control group. Fresh blood vessels were taken from 1 patient with AS who had been treated. The expression of miRNA-199a-3p in blood vessels, peripheral blood mononuclear cells and microbubbles were detected by real-time fluorescent quantitative PCR. miRNA-199a-3p mimics group and miRNA-199a-3p inhibitor group were transfected with miRNA-199a-3p mimics and miRNA-199a-3p inhibitor, and the blank control group was set up with human monocyte TTHP-1 as the vector. The levels of miRNA-199a-3p, chemokine monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1), RANTES and Fractalkine were detected by real-time fluorescent quantitative PCR.ResultsThe expression of miRNA-199a-3p in AS plaques was significantly higher than that in normal tissues (P<0.05). The expression of miRNA-199a-3p in peripheral blood mononuclear cells and microbubbles of coronary heart disease group were significantly higher than those of control group (P<0.05). Compared with that of blank control group, the expression level of miRNA-199a-3p in miRNA-199a-3p mimics group was significantly increased (P<0.05), miRNA-199a-3p expression level in miRNA-199a-3p inhibitor group was significantly decreased (P<0.05). Compared with those of blank control group, the mRNA expressions of MCP-1, RANTES and Fractalkine in miRNA-199a-3p mimics group were significantly decreased (P<0.05), mRNA expression of MCP-1, RANTES and Fractalkine in miRNA-199a-3p inhibitor group were significantly increased (P<0.05).ConclusionsmiRNA-199a-3p is highly expressed in macrophages of AS plaques and secreted into peripheral blood in microbubbles to inhibit the expressions of chemokines such as MCP-1, RANTES and Fractalkine in monocytes. miRNA-199a-3p is a protective factor for atherosclerosis.

Atherosclerosis; miRNA-199a-3p; Monocytes; Chemokines

国家自然科学基金资助项目(81260066)；云南科技计划项目(2013FB199)

龚昆梅(1967-)，女，教授，硕士生导师，主任医师，主要从事血管外科研究。

张 剑(1977-)，男，博士，副主任医师，主要从事血管外科研究。

R543.5

A

1005-9202(2017)16-3917-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.16.004