罗招凡 李芳萍 程 桦

(中山大学孙逸仙纪念医院检验科，广东 广州 510120)

抵抗素上调脂肪酸转位酶表达对HepG2 细胞脂质积聚的作用

罗招凡 李芳萍1程 桦1

(中山大学孙逸仙纪念医院检验科，广东 广州 510120)

目的探讨抵抗素在棕榈酸诱导下对HepG2肝细胞脂质积聚的作用及其对脂肪酸转位酶(FAT/CD36)表达调控的影响。方法50 ng/ml重组人抵抗素及0.5 mmol/L棕榈酸孵育HepG2肝细胞，之后用100 nmol/L胰岛素处理，采用实时定量RT-PCR检测胆固醇调节元件结合蛋白(SREBP)1 mRNA水平，流式细胞仪检测胞膜CD36表达，尼罗红(Nile Red)染色后激光共聚焦显微镜检测胞内脂质含量。结果与对照组相比，抵抗素增加胞膜FAT/CD36含量(P<0.05)，促进HepG2细胞SREBP1 mRNA表达(P<0.05)，使胞内红色脂肪小滴增多(P<0.05)。结论在高浓度游离饱和脂肪酸环境中，抵抗素在基础及胰岛素刺激状态下通过上调HepG2 的CD36 表达，刺激SREBP1转录，导致HepG2肝细胞内脂质积聚。

抵抗素；胰岛素；CD36；脂质积聚

脂毒性是指血中游离脂肪酸(FFA)水平升高后，超过脂肪组织的储存能力和各组织对FFA的氧化能力，使过多的FFA以甘油三酯(TG)等形式在非脂肪组织中过度沉积而造成对该组织的损伤。FFA与胰岛素抵抗(IR)密切相关，脂肪的异位沉积已被认为是形成IR的重要因素，而肝脏是最易也是较早发生脂肪异位沉积的部位。抵抗素参与调节糖代谢和导致IR〔1〕。以往人抵抗素对IR的体外研究多集中在内皮细胞及单核巨噬细胞，在肝细胞中的资料相对较少；而在高FFA环境中，人抵抗素是否会导致肝细胞脂代谢紊乱，是否会形成肝细胞内脂肪聚积，目前研究资料更是少见。脂肪酸转运酶(FAT/CD36)是一种膜糖蛋白，属于B 类清道夫受体家族，广泛分布于哺乳动物的多种组织细胞上，包括肝细胞、心肌和骨骼肌细胞、脂肪细胞等，在介导棕榈酸的跨膜转运中起着重要作用〔2〕。本课题拟研究抵抗素在棕榈酸诱导下对HepG2细胞脂质积聚的作用，并探讨其对FAT/CD36的表达调控。

1 材料与方法

1.1材料及主要试剂 抵抗素(美国Phoenix.Inc)；棕榈酸(美国Sigma公司)；胰岛素(Humulin，40 IU/ml，Lily公司)；DMEM培养基及胎牛血清(BSA)(美国Gibco公司)；PE鼠抗CD36抗体(美国BD PharmingenTM公司)；尼罗红(Nile Red)荧光染料(美国Sigma公司)；SYBR GreenⅠPCR 通用混合试剂(美国Applied Biosystems公司)。

1.2方法

1.2.1FFAs的配制 首先在37℃水浴中，将棕榈酸溶解于无水乙醇中配制成50 mmol/L的棕榈酸储存液。临用前37℃水浴按0.5%的浓度将BSA溶解于DMEM中，之后将棕榈酸储存液与含0.5% BSA(w/v)的DMEM混合并搅动1 h配制成500 μmol/L棕榈酸工作液，按比例加入4% BSA搅动10 min混匀，过滤除菌，4℃储存。

1.2.2Nile Red荧光染料的配制 取10 mg Nile Red溶解于100 ml丙酮，配制成0.1 mg/ml的Nile Red储存液，避光保存，临用时按1∶100稀释。

1.2.3细胞培养及分组干预 HepG2细胞用含50 ng/ml抵抗素(res50组)或不含抵抗素(res0组)的低糖DMEM培养液处理24 h，之后用去血清的无糖DMEM培养液(仍含对应浓度)饥饿3～5 h，然后用含0.5 mmol/L棕榈酸的低糖DMEM培养液处理16 h，接着用不含胰岛素或含100 nmol/L胰岛素的低糖DMEM培养液处理2 h，依次收集细胞行后续实验。

1.2.4RNA的提取及实时定量RT-PCR检测mRNA水平 收集细胞，用TRIZOL试剂分离提取总RNA，逆转录成cDNA，用SYBR GreenⅠ实时定量PCR进行扩增，扩增条件为95℃变性10 min，然后95℃15 s，60℃1 min，共40个循环。在PCR反应结束后采用溶解曲线方法验证反应的特异性。实验结果以管家基因18sRNA的循环阈值(Ct)作标准化，称为ΔCt，最终各基因的表达结果为2-ΔΔCT，其中-ΔΔCT 等于处理组的ΔCt减去对照组的ΔCT，对照组的2-ΔΔCT值为1。胆固醇调节元件结合蛋白(SREBP)1基因引物用Primer Express 2.0软件设计，其特异性及有效性在实验前均被证实。引物序列：SREBP1(NM_001005291)前向引物：5′-GCTCCTCCATCAATGACAAAATC-3′，反向引物：5′- TGCAGAAAGCGAATGTAGTCGAT-3′；18sRNA(NR_003286)前向引物：5′-CCTGGATACCGCAGCTAGGA-3′，反向引物：5′-GCGGCGCAATACGAATGCCCC-3′。

1.2.5流式细胞仪检测细胞膜CD36含量 取6孔板中一定量HepG2细胞(约1×106个细胞/ml)，冷磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后，用4%多聚甲醛1 ml室温固定40 min，离心去上清，加2 ml PBS重悬洗涤，再用1 ml含5%人血清的PBS重悬细胞，冰上孵育10 min，800 r/min离心5 min去上清。加入200 μl含0.5%BSA和饱和剂量荧光标记抗体(5×105个细胞/20 μl抗体)的PBS，避光冰上放置30 min，离心弃上清。加入200 μl 1%多聚甲醛固定，最后用流式细胞仪检测荧光值，每管计数1×104个细胞。以流式细胞仪的配套软件分析样品中细胞的相应标记阳性表达率。

1.2.6Nile Red染色激光共聚焦显微镜检测细胞内脂质含量 取24孔板中HepG2细胞去培养基，用冰的PBS洗1次，每孔加1 ml 1.5%戊二醛固定5 min之后移去固定液或无须固定，之后每孔加1 ml PBS，随即加入10 μl Nile Red染液(0.1 mg/ml)，至少孵育5 min，立即置于激光共聚焦显微镜下观察并拍照，激发光波长450～500 nm，发射光波长>528 nm。正常的HepG2细胞内未见或仅见很少脂肪小滴，而有脂质沉积的HepG2细胞则见红色或桔红色的脂肪小滴。激光共聚焦显微镜下计算HepG2细胞中脂肪小滴所占比例，0、1/4、1/2、3/4或满视野为界定范围，评估脂质含量为0～4分，每样本随机计数25个细胞。

1.3统计学方法 应用SPSS17.0软件，实验用不同批次细胞重复3次以上。组间比较采用方差分析(ANOVA)，方差齐性则多组间比较采用Scheffe检验，非正态数据多组间比较采用多组秩和检验(K-W)。

2 结 果

2.1抵抗素在基础及胰岛素刺激状态下对HepG2细胞内脂质含量的影响 在激光共聚焦显微镜下，正常的HepG2细胞质内未见或仅见很少量脂肪小滴。当HepG2细胞与500 μmol/L棕榈酸共孵育16 h后，在基础(res0组脂质含量评分0.68±0.48，res50组为1.48±0.59)及胰岛素刺激条件下(res0组脂质含量评分1.80±0.50，res 50组为2.52±0.65，抵抗素使胞内脂质含量增加，红色脂肪小滴增多(P<0.05)。见图1。

图1 抵抗素在基础及胰岛素刺激状态下对HepG2细胞内脂质含量的影响

2.2HepG2细胞中抵抗素在基础及胰岛素刺激状态下对SREBP1 mRNA表达的影响 与抵抗素未处理组相比，在基础组及胰岛素刺激状态下，抵抗素增加SREBP1 mRNA表达基础组：res0组为1，res50组为2.00±0.13；胰岛素组：res0组为2，58±0.10，res50组为5.10±0.19(P<0.05)。

2.3抵抗素在基础及胰岛素刺激状态下对HepG2细胞CD36含量的影响 与对照组(res0组)比较〔基础组(8.73±1.44)%，胰岛素组(16.94±0.65)%〕，抵抗素(50 ng/ml)在基础及胰岛素刺激状态下增加胞膜CD36含量〔基础组(15.33±1.06)%，胰岛素组(23.23±3.56)%〕(P<0.05)。

3 讨 论

棕榈酸属饱和脂肪酸，具有不易氧化脂解、易贮存的特点，更易导致机体脂代谢紊乱。人体血清中棕榈酸占总FFA的34%，是主要的FFA。在正常情况下，血清FFA的浓度为200～600 μmol/L，而在肥胖和糖尿病患者血浆中，FFA浓度可高达2 000 μmol/L〔3〕。本研究选用500 μmol/L棕榈酸孵育16 h，可模拟体内较高浓度的游离饱和脂肪酸的慢性作用。

SREBP是脂肪合成基因转录的重要调节因子，不但介导胆固醇生物合成的反馈调节，而且在脂肪酸合成中起重要的调节作用。SREBPs有两种，分别为SREBP1和SREBP2〔4〕，其中SREBP1选择性活化脂质合成相关酶基因，如脂肪酸合成酶(FAS)及ACC1等。SREBPs的基因表达调节发生在转录水平和转录后水平，其受调控的主要因素包括胰岛素〔5〕、葡萄糖〔6〕及多不饱和脂肪酸等〔7〕；此外，瘦素与SREBP1呈负调控关系〔8〕。本实验结果显示：在基础状态下，人抵抗素的慢性作用可上调HepG2细胞SREBP1 mRNA的表达，而胰岛素刺激条件下可使SREBP1 mRNA表达显著增加，表明抵抗素能调控HepG2细胞SREBP1的转录，促进脂肪酸的合成。

脂肪酸的跨膜转运对脂肪酸的摄入起着关键作用，机体组织摄取脂肪酸主要通过被动扩散和蛋白介导两种方式。短链及中链脂肪酸可直接通过被动转运进入细胞膜，而长链脂肪酸如棕榈酸等摄入需要膜上蛋白质如FAT/CD36的介导。Coort等〔9〕研究发现，在肥胖和DM前期Zucker大鼠，骨骼肌细胞摄入长链脂肪酸的速度明显增加，同时细胞膜FAT/CD36的表达也显著增强。同样，肥胖和T2DM患者中也观察到骨骼肌中长链脂肪酸摄入增加与肌内TG堆积密切相关〔10〕。 FAT/CD36的调节涉及基因水平的调节、蛋白水平的调节及其转位调节。Drover等〔11〕的研究发现，高水平的FFA可促进心肌、肝脏等FAT/CD36的基因表达及转录后的调节。本研究发现在基础状态下人抵抗素的慢性作用可显著增加HepG2细胞膜CD36含量，且在胰岛素刺激状态下，其胞膜CD36含量进一步上升，表明人抵抗素可能通过上调胞膜CD36含量，促进脂肪酸的摄取。抵抗素能通过抑制腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)活性显著减少L6 肌细胞膜CD36含量，从而减少脂肪酸的摄取，但细胞总的CD36含量并未发现改变，说明抵抗素对FAT/CD36的调节涉及的可能是转位调节。但本研究由于实验条件所限并未做mRNA定量及免疫印迹实验，不能说明人抵抗素调节CD36涉及的是何种水平的调节，这有待下一步的实验来完善。肝脏脂质异位沉积已被认为是形成IR的重要因素。van de Samuel等〔12〕的研究发现肝细胞脂肪沉积可以导致IR的发生，其结果显示高脂饮食喂养3 d的成年SD大鼠肝组织TG增高至对照组的3倍，并发生了肝脏IR。但其确切机制尚未完全阐明。另外，运动及某些药如二甲双胍、罗格列酮等可通过促进AMPK活化减少SREBP1 mRNA及其下游合成脂质靶基因表达〔13〕。此外，胰岛素在提高肝脏脂肪蓄积上也是个重要的因子，胰岛素选择性刺激肝脏SREBP1c转录、活化，导致肝脂肪酸合成增加、TG聚积，引起脂肪肝。本研究结果提示，抵抗素导致胞内脂质含量增加可能通过刺激SREBP1c转录、活化而导致胞内脂肪酸合成增加、TG聚积。

综上所述，在高浓度游离饱和脂肪酸环境中，抵抗素在基础及胰岛素刺激状态下通过上调HepG2细胞膜CD36的表达，增加细胞外脂肪酸转入细胞内，刺激SREBP1转录，造成HepG2肝细胞脂质的异常沉积。

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5Eberle D，Hegarty B，Bossard P，etal.SREBP transcription factors：master regulators of lipid homeostasis〔J〕.Biochimie，2004;86(11)：839-48.

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〔2016-11-15修回〕

(编辑 袁左鸣)

Therecombinanthumanresistinexacerbatesintracellularlipidaccumulationviaup-regulatingCD36inHepG2cells

LUOZhao-Fan,LIFang-Ping,CHENGHua.

DepartmentofClinicalLaboratory,theSunYat-senMemorialHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510120,Guangdong,China

ObjectiveTo investigate the role of recombinant human resistin (rh-resistin) in the palmitate inducing intracellular lipid accumulation in HepG2 cells and explore the effect of rh-resistin on fatty acid translocase(FAT/CD36).MethodsCells were treated with or without 50 ng/ml rh-resistin in the same condition, followed by serum-starving in glucose-free DMEM for 3～5 hours in the continued presence or absence of rh-resistin. Then cells were incubated with 0.5 mmol/L palmitate for 16 h followed by with or without 100 nmol/L insulin for 2 hours. Sterol regulatory element binding protein1 (SREBP1) mRNA expression levels were determined by real time RT-PCR. The cell surface CD36 content was measured by immunofluorescent flow cytometry analysis. The lipid accumulation in cells was determined by Nile red staining, and images were obtained on a Laser Scanning Confocal Microscope.ResultsIncubation with 0.5 mmol/L palmitate, in both basal and insulin-stimulated conditions, rh-resistin increased cell surface CD36 content, stimulated SREBP1 mRNA expressions and exacerbated intracellular lipid accumulation in HepG2 cells.ConclusionsIn the high concentration of free saturated fatty acid environment, resistin in the basal and insulin could stimulate state by up-regulating HepG2 CD36 expression, stimulate SREBP-1 transcription, leading to HepG2 liver cell intracellular lipid accumulation.

Resistin；Insulin；CD36；Lipid accumulation

国家自然科学基金资助项目(30570886)；教育部留学回国人员科研启动基金资助项目(教外司留〔2015〕1098号)；广东省自然科学基金资助项目(2016A030313345)

罗招凡(1972-)，女，博士，副主任技师，主要从事代谢综合征与肿瘤的基础研究。

R589

A

1005-9202(2017)16-3914-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.16.003

1 中山大学孙逸仙纪念医院内分泌科