HPLC法测定南瓜中β-胡萝卜素

2017-09-14邓俊琳朱永清刘小俊梁根云张盈娇

中国食物与营养 2017年8期

关键词：丙酮胡萝卜素南瓜

邓俊琳，朱永清，刘小俊，杨宏，梁根云，陈建，夏陈，张盈娇，李娟

(1四川省农业科学院农产品加工研究所，成都 610066；2四川省农业科学院园艺研究所/蔬菜种质与品种创新四川省重点实验室，成都 610066)

HPLC法测定南瓜中β-胡萝卜素

邓俊琳1，朱永清1，刘小俊2，杨宏2，梁根云2，陈建1，夏陈1，张盈娇1，李娟1

(1四川省农业科学院农产品加工研究所，成都 610066；2四川省农业科学院园艺研究所/蔬菜种质与品种创新四川省重点实验室，成都 610066)

目的：建立高效液相色谱法(HPLC)测定南瓜中β-胡萝卜素含量的方法，并对12份南瓜样品中β-胡萝卜素含量进行测定。方法：色谱柱：Eclipse XDB-C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：水(A)+丙酮(B)；检测波长：450nm。结果：南瓜中β-胡萝卜素在35 min内得到较好分离，重复性好(RSD=5.11%)，精密度高(RSD=0.70%)，稳定性好(RSD=2.73%)，加标回收结果准确可靠(RSD=2.06%)。12份南瓜样品中β-胡萝卜素含量差异较大(8.9～94.4 μg/g)，印度南瓜16296-1中β-胡萝卜素含量最高，其次为中国南瓜9132、印度南瓜16291-2和16167-8，这3种南瓜中β-胡萝卜素含量较接近(均≥76 μg/g)，含量最低的为印度南瓜16185-6。结论：建立了一种快速测定南瓜中β-胡萝卜素的高效液相色谱方法，该方法准确、可靠；12份南瓜样品中β-胡萝卜素含量差异较大。

南瓜；β-胡萝卜素；HPLC

南瓜耐干旱贫瘠、适应能力较强，广泛栽培于世界各地。据统计，2013年我国南瓜栽培面积达 38.77 万hm2，总产量在 710 万t左右，是世界上最大的南瓜生产国。南瓜营养丰富且全面，富含果胶、纤维素、淀粉、脂肪、甘露醇、维生素、生物碱、β-胡萝卜素等[1]。研究表明，南瓜具有降血糖、预防动脉粥样硬化和冠心病作用、防癌、解毒、保肝肾、抗氧化等诸多功效[2-4]。

自然界中胡萝卜素主要包括有α、β、γ等异构体，其中以β-胡萝卜素的活性最高。研究表明，补充 β-胡萝卜素或提高β-胡萝卜素血浓度，通过抗氧化、增强机体免疫能力以及促进细胞缝隙连接等作用，抑制或降低癌症的发生和发展[5]。β-胡萝卜素可直接抑制和淬灭由电离辐射产生的活性单线态氧，维护线粒体膜的完整性，阻止自由基的进一步产生，减轻放射线对人体产生的毒副作用[6]。此外，β-胡萝卜素还有预防心血管疾病、增强免疫、补充人体维生素A等诸多功效[7-9]。随着对其认识的不断深入，β-胡萝卜素已被广泛用于食品、工业、化妆品、医药等诸多领域。

大多数南瓜呈现黄色或橙色，与其高含量的类胡萝卜素有关，主要是β-胡萝卜素和α-萝卜素[10]。β-胡萝卜素不仅与南瓜色泽有关，还与一些南瓜生理活性有密切关联。Na-Rae Kim等[11]研究表明，β-胡萝卜素可能是南瓜改善抑郁的主要活性成分。β-胡萝卜素是维生素A的前体，南瓜因含有高含量的β-胡萝卜素而被认为是缺乏维生素A的儿童和妇女们日常膳食的潜在补充源[12]。β-胡萝卜素作为南瓜的重要功效成分，对其品质有直接影响，但到目前为止，南瓜中β-胡萝卜素的检测并未见一种检测前处理简单、检测方法准确可靠、检测效率高的方法。本文建立了一种简单、快速、准确的HPLC检测方法，并对该方法进行方法学考察，以及对12份南瓜样品中的β-胡萝卜素含量进行测定，以期为南瓜中β-胡萝卜素的快速检测和深入研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

南瓜：2017年2月9日采收于四川省农科院海南试验基地。样品详细信息见表1。鲜样去皮和瓤，取果肉切片打浆，称取1g于研砵中，加丙酮研磨至无色，将研磨液定容至25mL，0.22μm滤膜过滤于液相进样瓶中待测。各试剂均为色谱纯，β-胡萝卜素标准品购于北京索莱宝科技有限公司(纯度≥98%)。

电子天平，奥豪斯仪器(上海)有限公司；1260型高效液相色谱仪，美国Agilent公司。

1.2 试验方法

1.2.1 色谱条件色谱柱：Eclipse XDB-C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；DAD检测器，检测波长450nm；柱温：25℃；进样量：20μL；流速：1.5mL/min；流动相：水(A)+丙酮(B)，梯度洗脱：0～30min，75%～95%(B)；30～32min，95%～100%(B)；32～35min，100%(B)。

表1 12份南瓜材料

1.2.2 β-胡萝卜素标准品溶液的制备准确称取β-胡萝卜素标准品14.5mg，置于25mL容量瓶中，丙酮溶解并定容，得浓度为580μg/mL的标准品母液，对该母液分别稀释10、20、100、200、1 000、2 000倍，配置不同浓度的标准品溶液。

1.2.3 南瓜样品溶液的制备分别精确称取同一批南瓜样品3份，每份1g，置于研钵中，加入少量石英砂，丙酮研磨提取至无色，30℃水浴减压浓缩，丙酮定溶于25mL容量瓶，0.22μm微孔滤膜过滤，作为样品待测液。

2 结果与分析

2.1 β-胡萝卜素标准品溶液和南瓜样品的HPLC色谱

由附图可知，在南瓜样品色谱图中的33.215min处有色谱峰，其保留时间与标准品的色谱峰保留时间33.280min基本一致。在此色谱条件下，南瓜样品中的β-胡萝卜素得到较好的分离。

附图 β-胡萝卜素标准品(a)和南瓜样品(b)的HPLC色谱

2.2 方法学验证

2.2.1 标准曲线和线性关系在1.2.1色谱条件下分别对浓度为0.28、0.57、2.87、5.687、28.42、56.83 μg/mL的β-胡萝卜素标准品进样20 μL色谱分析。以浓度(X，μg/mL)为横坐标、峰面积(Y)为纵坐标绘制标准曲线，得β-胡萝卜素的线性方程为Y=61.866X-8.371 6(R2=0.999 8)，β-胡萝卜素的峰面积和浓度之间呈良好的线性关系。

2.2.2 重复性试验按照1.2.3的方法平行制备南瓜样品溶液5份，以1.2.1的色谱条件进行色谱测定分析，计算β-胡萝卜素平均提取量为24.55μg/g，其相对标准偏差(RSD)为5.11%，表明试验方法重复性良好。

2.2.3 精密度试验按照1.2.2的方法制备β-胡萝卜素标准品溶液1份，以1.2.1的色谱条件连续进样5次，计算β-胡萝卜素峰面积的RSD，为0.70%，表明仪器精密度良好。

2.2.4 稳定性试验按照1.2.3的方法制备南瓜样品溶液1份，以1.2.1的色谱条件分别在时间为0、2、4、6、8 h进样，计算β-胡萝卜素峰面积的RSD，为2.73%，表明试验稳定性良好良好。

2.2.5 回收率试验称取5份南瓜样品于研砵中，分别加入相同的β-胡萝卜素标准品，以1.2.3的方法制备样品，再按1.2.1的色谱条件进行分析。结果显示，β-胡萝卜素的平均加标回收率为93.922 5%，RSD为2.06%(表2)，表明试验方法有较好的回收率，回收结果准确可靠。

2.2.6 12份南瓜材料中β-胡萝卜素的含量由表2可知，南瓜中β-胡萝卜素含量差异显著，不同类型南瓜或者相同类型的南瓜中β-胡萝卜素含量有较大差异。其中，β-胡萝卜素含量最高为印度南瓜16296-1，为94.4μg/g，其次为印度南瓜16167-8、16291-2和中国南瓜9132，含量均在75～80μg/g之间；印度南瓜16183-1和中国南瓜9133中含量均为13.9μg/g；β-胡萝卜素含量最低为印度南瓜16185-6，仅含8.9μg/g。

表2 β-胡萝卜素的加标回收率(n=6)

表3 南瓜中β-胡萝卜素含量单位：μg/g

3 讨论

β-胡萝卜素属于脂溶性维生素，由于其分子中存在多个共轭双键，对光、热、氧不稳定，易被氧化、降解而降低其生物学活性[13]。测定β-胡萝卜素的方法主要有纸层析法、薄层层析法、柱层析法、分光光度法和高效液相色谱法等。薄层层析法、纸层析法及柱层析法只能对β-胡萝卜素进行定性分析，要确定量的大小必须结合紫外分光光度计[14]。高效液相色谱法是目前测定β-胡萝卜素含量最简便的方法，其操作简单、效率高、准确度高，还可同时测定α、β-胡萝卜素及其他类胡萝卜素[15]。刘秋芬等[16]以国家标准 GB/T 50089-2003的方法用HPLC法测定了8个南瓜品种果实中的β-胡萝卜素，但该方法需经过提取、浓缩、纯化等复杂的前处理，测定样品量较大时，难度增加。β-胡萝卜素对许多物理、化学、生物因素都不稳定，但其检测前一般要经过皂化、溶剂萃取、分离、浓缩等多次操作，检测前的步骤越多，越易对β-胡萝卜素造成损失[14]。Sarungallo等[17]采用柱切换技术完成食品添加剂中的β-胡萝卜素的在线准备与分离，该方法节省了大量检测前期工作，但由于需要利用色谱柱切换技术，因此其应用目前还较少。本次实验中β-胡萝卜素的提取、检测过程简单，不需要经过复杂的纯化步骤，且建立的方法重复性好(RSD=5.11%)，精密度高(RSD=0.70%)，稳定性好(RSD=2.73%)，加标回收结果准确可靠(RSD=2.06%)。在35 min内较好地将β-胡萝卜素进行了分离，峰型对称、基线平稳、分离度高。色谱分离过程中的流动相为丙酮和水，无需调节酸碱，流动相中无盐离子，对色谱柱较温和。

4 结论

本实验以丙酮和水作为流动相，采用梯度洗脱的方式，较好地将β-胡萝卜素在35min内进行了分离，且测定结果的重复性好(RSD=5.11%)，精密度高(RSD=0.70%)，稳定性好(RSD=2.73%)，加标回收结果准确可靠(RSD=2.06%)。以此色谱条件测定12份南瓜材料中的β-胡萝卜素含量，其结果表明：12份南瓜样品中β-胡萝卜素含量差异较大，印度南瓜16296-1中β-胡萝卜素含量最高，为94.4μg/g，其次为中国南瓜9132、印度南瓜16291-2、印度南瓜16167-8，含量均≥76μg/g，含量最低的印度南瓜16185-6，仅有8.9μg/g。◇

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[17]Sarungallo Z L，Hariyadi P，Andarwulan N，et al.Analysis of α-cryptoxanthin，β-cryptoxanthin，α-carotene，and β-carotene of Pandanus conoideus oil by high-performance liquid chromatography(HPLC)[J].Procedia Food Science，2015(3)：231-243.

(责任编辑李婷婷)

Determination on β-carotene in Fresh Pumpkin by HPLC Method

DENG Jun-lin1，ZHU Yong-qing1，LIU Xiao-jun2，YANG Hong2，LIANG Gen-yun2，CHEN Jian1，XIA Chen1，ZHANG Ying-jiao1，LI Juan1
(1Institute of Agro-Products Processing Science and Technology，Sichuan Academy of Agricultural Sciences，Chengdu 610066，China；2Institute of Horticulture Research Institute，Sichuan Academy of Agricultural Sciences/Vegetable Germplasm Innovation and Variety Improvement Key Laboratory of Sichuan Province，Chengdu 610066，China)