王 雪 金 朗 王炳强

(沧州医学高等专科学校基础医学部药理教研室,河北 沧州 061000)

马钱子碱对人结肠癌细胞HT-29增殖与凋亡的影响及相关机制

王 雪 金 朗1王炳强2

(沧州医学高等专科学校基础医学部药理教研室,河北 沧州 061000)

目的探讨马钱子碱对人结肠癌细胞HT-29增殖与凋亡的影响及其分子机制。方法以人结肠癌细胞HT-29为研究对象，将其按不同处理方式分为空白对照组，马钱子碱(1 μmol/L)处理组、白细胞介素(IL)-6(100 μg/L)处理组、马钱子碱联合IL-6处理组。CCK8法检测细胞增殖情况；Annexin-V-PI双染法检测细胞凋亡情况；细胞免疫荧光染色检测p-STAT3蛋白表达的位置和强度，Western印迹法检测凋亡相关蛋白表达量。结果马钱子碱处理组、马钱子碱联合IL-6处理组均可明显抑制细胞增殖且马钱子碱处理组细胞抑制率明显高于马钱子碱联合IL-6处理组(P<0.05)。马钱子碱处理组、马钱子碱联合IL-6处理组细胞凋亡率明显高于空白对照组且马钱子碱处理组细胞凋亡率明显高于马钱子碱联合IL-6处理组(P<0.05)；IL-6处理组细胞凋亡率与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。马钱子碱处理组p-STAT3比值明显低于空白对照组(P<0.05)；同时马钱子碱浓度越高p-STAT3蛋白表达量越低。马钱子碱处理组p-STAT3和抗凋亡BCL-2蛋白表达量明显低于空白对照组，促凋亡蛋白Bax、执行凋亡的DNA修复酶Parp表达量明显高于空白对照组(P<0.05)；IL-6处理组的p-STAT3蛋白表达量明显高于空白对照组(P<0.05)；马钱子碱联合IL-6处理组BCL-2蛋白表达量明显高于马钱子碱处理组，而Bax和DNA修复酶Parp表达量明显减少(P<0.05)。结论马钱子碱可有效抑制结肠癌细胞HT-29增殖并促进凋亡，其主要通过调节IL-6/ STAT3信号通路，抑制细胞中STAT3磷酸化来实现。

马钱子碱；结肠癌；细胞凋亡；IL-6/STAT3通路

结肠癌复发或转移率很高〔1〕。马钱子为马钱属植物马钱的成熟种子，马钱子碱是其中主要活性成分之一，具有抗菌、抗感染、抑制中枢神经等多种药理学作用〔2〕，近年来马钱子碱抗肿瘤作用成为该领域的研究热点。研究已发现，马钱子碱可有效抑制乳腺癌、肝癌、肺癌细胞的增殖〔3〕，但具体分子机制仍未明确。本文拟观察马钱子碱对结肠癌HT-29细胞活性的影响。

1 材料与方法

1.1材料 人结肠癌细胞HT-29购于上海羽朵生物科技有限公司；马钱子碱购于上海纯优生物科技有限公司；1640细胞培养基购于北京万域美澜科技有限公司；CCK8试剂盒、Annexin-V-PI-双染凋亡检测试剂盒均购于上海玉博生物科技有限公司；p-STAT3、STAT3 、GAPDH 抗体均购于美国BD公司；荧光二抗购于美国Abbkine公司；IL-6、DAPI、ECL化学发光试剂均购于上海研卉生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1CCK8法检测细胞增殖情况 设空白对照组、马钱子碱(1 μmol/L)处理组、IL-6(100 μg/L)处理组、马钱子碱联合白细胞介素(IL)-6处理组。取对数生长期的HT-29细胞按5×103个/孔的密度将细胞悬液接种到96孔板上，放入5%CO2浓度的孵箱中1 d，弃上清，根据分组情况加入对应的马钱子碱、IL-6。放入RPMI 1640细胞培养液继续孵育1 d后，各孔滴入20 μl CCK8试剂，培养2 h，读取450 nm处吸光度值，计算细胞增殖抑制率。用光学显微镜观察各组细胞形态变化。

1.2.2Annexin-V-PI双染法检测HT-29细胞凋亡 研究分组同1.2.1，取对数生长期的HT-29细胞悬液接种到6孔板中，放入5%CO2浓度的孵箱中培养24 h后弃去上清，根据分组加入马钱子碱、IL-6，培养24 h后用磷酸缓冲液冲洗细胞3次，按试剂盒说明书加入Annexin-V-FITC、PI，4℃暗室反应45 min，加300 μl含Ca2+的缓冲液，均匀混合后上流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.2.3免疫荧光染色 细胞培养至对数生长期，按1×108个/孔浓度接种到6孔板中，分为空白对照组、1 μmol/L、4 μmol/L马钱子碱处理组。培养1 d后用磷酸缓冲液冲洗3次，室温下用10%多聚甲醛固定40 min，磷酸缓冲液洗涤后加入1 ml 0.1%的Trition溶液，室温下反应30 min，再用磷酸缓冲液洗涤后加5%的BSA封闭60 min。滴加相应的一抗，4℃过夜，加荧光二抗(1∶1 000)，室温下孵育2 h；加DAPI溶液，室温下暗室放置30 min，磷酸缓冲液洗涤，荧光显微镜下观察。

1.2.4Western印迹检测 将处理后的细胞冲洗后加RIPA蛋白裂解液，离心后取上清，测定蛋白浓度，在100 μl SDS-PAGE蛋白上样缓冲液中水浴10 min，进行SDS-PAGE电泳，湿法转膜后封闭2 h，分别滴加STAT3、p-STAT3、GAPDH 抗体，4℃过夜，次日用磷酸缓冲液冲洗后滴加荧光二抗，室温下摇床放置2 h，洗涤后ECL发光试剂显影，暗室中胶片感光。

1.3统计学分析 采用SPSS21.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1各组对HT-29细胞增殖的影响 CCK8法检测显示，空白对照组、马钱子碱处理组、IL-6处理组、马钱子碱联合IL-6处理组细胞增殖抑制率分别为(0.39±0.12)%、(32.80±1.94)%、(3.26±0.83)%、(19.63±2.31)%。马钱子碱处理组、马钱子碱联合IL-6处理组均可明显抑制细胞增殖；马钱子碱浓度相同时，马钱子碱处理组的细胞抑制率明显高于马钱子碱联合IL-6处理组，差异有统计学意义(P<0.05)。光镜下观察，马钱子碱处理组细胞变圆、较多细胞呈低折光率；马钱子碱联合IL-6处理组细胞变圆，低折光率细胞较少。见图1。

图1 4组HT-29细胞经处理后形态变化(×400)

2.2单用马钱子碱和马钱子碱联合IL-6对HT-29细胞凋亡的影响 Annexin-V-PI双染法检测显示，空白对照组、马钱子碱处理组、IL-6处理组、马钱子碱联合IL-6处理组细胞凋亡率为(2.04±0.67)%、(1.86±0.71)%、(21.37±3.50)%、(14.15±2.81)%。马钱子碱处理组、马钱子碱联合IL-6处理组的细胞凋亡率明显高于空白对照组，马钱子碱处理组细胞凋亡率明显高于马钱子碱联合IL-6处理组(P<0.05)；IL-6处理组细胞凋亡率与空白对照组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3马钱子碱对HT-29细胞中p-STAT3蛋白水平的影响 空白对照组、1 μmol/L、4 μmol/L马钱子碱处理组p-STAT3蛋白表达量和总STAT3蛋白表达量分别为：(98.14±5.37)、(57.26±4.09)、(13.61±2.18)；(38.61±9.10)、(35.39±6.24)、(33.55±6.95)。1、4 μmol/L马钱子碱处理组p-STAT3比值均明显低于空白对照组(P<0.05)且马钱子碱浓度越高p-STAT3蛋白表达量越低。3组总STAT3蛋白表达水平之间差异无统计学意义(P>0.05)；见图2。免疫荧光显示：p-STAT3蛋白在空白对照组细胞中为绿色荧光，多分布于细胞核中；4 μmol/L马钱子碱处理组绿色荧光强度明显弱于空白对照组。

图2 马钱子碱对HT-29细胞中p-STAT3蛋白表达的抑制作用

2.4IL-6介导的p-STAT3升高对马钱子碱促进HT-29凋亡的影响 1 μmol/L马钱子碱处理组p-STAT3和抗凋亡BCL-2蛋白表达量分别为：(16.05±1.90)、(26.81±5.57)明显低于空白对照组的(30.97±8.11)、(53.18±10.08)，促凋亡蛋白Bax、执行凋亡的DNA修复酶PARP表达量分别为：(11.59±4.91)、(15.03±2.45)明显高于空白对照组的(5.27±1.05)、(7.91±1.85)；差异均有统计学意义(P<0.05)。100 μg/L IL-6处理组的p-STAT3蛋白表达量为(30.91±5.37)明显高于空白对照组的(18.16±9.21)，差异有统计学意义(P<0.05)。马钱子碱联合IL-6处理组BCL-2蛋白表达量为(20.51±3.38)明显高于马钱子碱处理组的(9.57±5.62)而Bax和DNA修复酶Parp表达量明显减少(P<0.05)。

3 讨 论

马钱子碱对多种肿瘤细胞具有明显抑制作用，其可通过影响线粒体去极化和Ca2+浓度来抑制肝癌细胞HepG2的体外增殖，诱导细胞凋亡，还可通过影响相关信号通路来降低细胞侵袭力，抑制血管生成。肺癌细胞体外研究中，马钱子碱通过抑制NF-Kb和Cox2基因表达水平来介导细胞凋亡〔4〕。骨髓瘤体外研究中，马钱子碱可激活JNK信号通路来诱导细胞凋亡。以上研究提示，马钱子碱可通过诱导肿瘤细胞凋亡、阻滞细胞周期、抑制血管生成来发挥抗肿瘤作用〔5〕。

STAT3是IL-6/JAK、SRC、EgfR等多个致癌性信号通路的交接点，该靶点的活化在肿瘤发展中起到关键作用。STAT3在卵巢癌、前列腺癌、骨髓瘤等多种癌细胞中均存在过度表达〔6〕。STAT3高表达可激活相关基因，刺激细胞分化、增殖，抑制细胞凋亡，促进血管生成，表现出致癌作用〔7〕。本次研究显示，马钱子碱可降低人结肠癌HT-29细胞中p-STAT3表达水平，抑制增殖，促进凋亡；同时其还可上调HT-29细胞中促凋亡蛋白Bax表达水平，降低抗凋亡蛋白BCL-2表达水平，增加执行凋亡的DNA修复酶Parp含量，介导人结肠癌HT-29细胞凋亡。同时给予IL-6和马钱子碱时，由于IL-6能够维持并激活人结肠癌HT-29细胞中p-STAT3水平，从而减弱了马钱子碱抑制HT-29细胞凋亡的能力。

本实验通过体外研究明确了马钱子碱可介导IL-6/ STAT3信号通路，抑制人结肠癌细胞HT-29中STAT3磷酸化，进而减缓细胞增殖，促进细胞凋亡，起到抑癌作用。

1张海璐，邓 婷，白 明，等.左右半结肠癌临床特点及生存预后的比较〔J〕.中国老年学杂志，2015；35(9)：2446-7.

2李仙仙.马钱子碱对人白血病细胞株HL-60细胞的作用研究〔D〕.太原：山西医科大学，2013.

3Liu P，Zhang X，Xu W，etal.Electrochemical sensor for the determination of brucine in human serum based on molecularly imprinted poly-o-phenylenediamine /SWNTs composite film〔J〕.Sens Actuators B Chem，2012；163(1)：84-9.

4Wang X，Dong H，Yang B.etal.Large-scale separation of strychnine and brucine from Strychnos nux-vomica L.by pH-zone-refining counter-current chromatography〔J〕.J Liquid Chromatography Relat Technol，2013；36 (5/8)：648-57.

5于淑坤.综合放松训练对结肠癌围术期患者免疫功能的影响〔J〕.北华大学学报(自然科学版)，2014；15(2)：214-7.

6Chen ZP，Xiao L，Liu D.etal.Synthesis of a novel polymer cholesterol-poly(ethylene glycol) 2000-glycyrrhetinic acid (chol-PEG-GA) and its application in brucine liposome〔J〕.J Appl Polymer Sci，2012；124(6)：4554-63.

7Mishra SD，Bose D，Shukla SK,etal.Monitoring strychnine and brucine in biochemical samples using direct injection micellar liquid chromatography〔J〕.Analytical Method，2013；5(7)：1747-54.

〔2016-11-17修回〕

(编辑 郭 菁)

沧州市科技支撑基金项目(131302066)

王 雪(1981-)，女，硕士，讲师，主要从事药理学研究。

R73

A

1005-9202(2017)17-4194-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.17.011

1 沧州市人民医院药学部 2 沧州市妇幼保健院药剂科