张正社， 牛 娜， 宋瑜龙， 马守才， 张改生， 王军卫*

(1. 西北农林科技大学农学院 国家杨凌农业生物技术育种中心/国家小麦改良中心杨凌分中心/小麦育种教育部 工程研究中心/陕西省作物杂种优势研究与利用重点实验室， 陕西 杨凌 712100；2. 旱区作物逆境生物学国家重点 实验室， 陕西 杨凌 712100；3. 草地农业生态系统国家重点实验室 兰州大学草地农业科技学院， 甘肃 兰州 730020)

我国土壤全钾含量在0.05%～2.5%之间，呈由南向北降低趋势，钾元素的亏缺是一个全国性的严重问题[1]。目前我国耕地有30%以上表现为缺钾(有效钾含量小于50 mg·kg-1)甚至严重缺钾，土壤供钾不足已严重影响着农作物的生产[2]。相关调查显示，目前我国耕地土壤速效钾含量依然在逐年减少，年减少量已达到0.58～3.32 mg·kg-1。虽然农业生产上每年都会施入大量的钾肥，但是钾元素的当季利用率较低，仅有20%～60%，加之我国又是钾矿资源缺乏的国家[3]。因此，发掘优良的种质资源，培育耐低钾品种，已成为众多研究者亟需解决的问题。

钾作为植物生长发育的必要元素，参与植物体内60多种酶的活化，对于提高作物产量、改善作物品质、增强作物的抗逆性起着非常重要的作用[4-6]。有关基因型耐低钾指标的筛选及鉴定的研究在国外开展较早[7]，国内起步较晚，且多集中于水稻(Oryzasativa)[8-9]、玉米(Zeamays)[10]、甘薯(Ipomoeabatatas)[1]、棉花(Gossypiumspp)[11]、大麦(Hordeumvulgare)[12]、小麦(Triticumaestivum)[13]等作物，而有关山羊草(Aegilops)的研究目前尚未见报道。山羊草是小麦的近缘属植物，在生物进化过程中，山羊草不但适应了各种逆境条件，而且还保留了许多优良的抗逆特性，因此，被广泛应用为远缘杂交育种的试验材料[14]。

本研究以小麦的近缘种山羊草为试验材料，采用水培方法研究低钾条件下不同山羊草种质苗期的生长发育及钾营养特性，基于多项指标计算隶属函数值，综合评价供试山羊草种质的耐低钾胁迫特性，筛选和鉴定耐低钾基因型，为进一步研究山羊草的耐低钾分子机制，以及育种上利用耐低钾山羊草种质提供了材料和理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用材料为9个山羊草种质(表1)，由西北农林科技大学农学院小麦杂优利用课题组提供。

表1 供试山羊草种质Table 1 Aegilops germplasm

1.2 试验方法

1.2.1盆栽试验 挑选籽粒均匀、饱满的山羊草种子，首先用9%的双氧水对种子进行30 min的消毒，然后用蒸馏水冲洗干净，浸泡在培养皿中放入恒温(21℃)培养箱中暗培养至露白，等出芽后转移至光照条件下，根据情况补充水分培养2天，挑选长势均匀的幼苗移栽到80 mm×120 mm花盆中，1～2 mm石英砂做基质。移栽初期用蒸馏水浇苗，等幼苗长到三叶期使用Hoagland营养液(pH=6.0，表2)处理幼苗[11]。试验设正常供钾(2.0 mmol·L-1KCl)和低钾(0.02 mmol·L-1KCl)两个处理，每种山羊草种4盆，每盆5株，其中1盆作为对照，其余3盆为重复处理[11,13]。从第一次营养液处理开始计时，每2天浇一次营养液，连续处理40天。培养过程中观察叶色、叶形等的变化，并进行拍照记录。盆栽试验于2014年3月-4月在西北农林科技大学农学院综合楼实验室进行，室温保持在21℃，每天保持光照12小时。

表2 营养液配方Table 2 Nutrient solution formula

注：*正常钾浓度为2.0 mmol·L-1，低钾浓度为0.02 mmol·L-1
Note: *Normal potassium level was 2.0 mmol·L-1KCl, low potassium level was 0.02 mmol·L-1KCl

1.2.2测定指标及方法 在山羊草的六叶期，对植株进行收获，地上部和根部分开，分别装入纸袋中。置于烘箱内进行105℃杀青30 min。80℃下烘干8 h，称重，再烘干2 h 称重，两次重量差异在1% 内即可。否则再进行烘烤。

测定指标：根长、地上部长、根冠比、根干重、地上部干重、含钾量、钾积累量、钾利用效率。钾利用效率 = 全株干重/全株钾积累量，钾积累量 = 植株干重×植株含钾量[15]。

含钾量用火焰分光光度计测定[16]。采用浓H2SO4-H2O2消煮法制备待测液，并利用原子吸收光谱仪(由西北农林科技大学水土保持研究所提供)测定钾离子含量。钾含量的计算方法[17]：K/% = (c×V×ts× 10-4)·m-1

式中，c：从标准曲线查得显色液钾离子的质量浓度(mg·L-1)；V：显色液体积(mL)；ts：分取倍数；m：烘干样品质量(g)。

1.2.3数据分析 为消除不同种质个体间的差异，不同种类山羊草间的相互比较用相对值(相对性状值=低钾状态下性状值/正常供钾状态下同一性状值)，同一种山羊草的不同处理比较用绝对值(实际测量值)。

用Excel软件对数据进行处理，利用SPSS软件对处理后数据进行相关性分析、主成分分析[18]。并利用隶属函数值对几种山羊草的耐低钾特性进行综合评价[13,19-22]。运用公式如下：

U(Xj) = (Xj-Xmin)·(Xmax-Xmin)-1
j= 1, 2……n

(1)

Wj=Pj·(∑Pj)-1j= 1, 2 …… n

(2)

Di= ∑[U(Xj) ×Wj]i= 1, 2 …… k

(3)

隶属函数值公式(1)中Xj表示第j个因子得分值，Xmin，Xmax分别表示第j个因子得分的最小值和最大值。

权重公式(2)中Wj表示第j个公因子在所有公因子中的重要程度，Pj为第j个公因子的贡献率。

综合评价公式(3)中Di为材料在低钾条件下用综合指标评价所得的耐低钾特性综合评价值，k为材料个数。

2 结果与分析

2.1 山羊草苗期表型观察

在提供正常钾素水平培养液的情况下，幼苗生长良好，茎秆粗壮、直立，叶色青绿，生长正常；在缺钾条件下，仅有个别材料与对照差异不明显外，其余材料同对照相比均表现出茎短细弱，叶色暗淡且没有光泽，并出现倒伏(图1)。其病状首先出现在老叶上，表现为缺绿斑点，有些甚至呈烧焦状，呈现出明显的缺钾症状。

2.2 山羊草苗期耐低钾基因型筛选指标分析

确定有效地筛选指标对筛选山羊草钾高效基因型至关重要，而基因型变异程度是衡量筛选指标是否适宜的重要依据，变异程度越大，说明该性状指标越能代表基因型间的差异。如表3和表4所示，不同基因型山羊草(苗期)不同钾素处理水平下，各性状间表现出很大差异，在正常钾处理条件下，变异系数较大的性状是根长、根冠比、地上干重、钾积累量和钾利用效率，其最大值和最小值的倍数关系分别是4.67，3.19，47.84，78和2.33；在低钾处理条件下，变异系数较大的性状是根长、根冠比、地上干重、含钾量、钾积累量和钾利用效率，其最大值和最小值的倍数关系分别是16.95，4.15，18.5，2.83，13.2和2.75。

图1 9种山羊草在不同钾水平下的苗期生长表现Fig.1 Growth performances of nine Aegilops genotype germplasms in the seedling stage under different potassium levels

表3 正常钾处理下山羊草苗期各指标的变异Table 3 Variation of indexes in the seedling stage of Aegilops under normal potassium treatment setting

表4 低钾处理下山羊草苗期各指标的变异Table 4 Variation of indexes in the seedling stage of Aegilops under low potassium treatment setting

为了消除基因型间自身生物学特性的差异，确定主要筛选指标，对变异系数较大的5个性状指标在正常钾处理和低钾处理水平下的相对变化做进一步分析。结果如表5所示，变异系数的大小为相对地上干重(105%)>相对钾积累量(104.64%)>相对钾利用效率(37.11%)>相对根长(29.30%)>相对根冠比(28.80%)，这5个性状变异系数均较大，说明他们对于不同山羊草基因型的耐低钾的灵敏度较高，可以作为苗期钾高效种质筛选的重要指标。

表5 不同钾处理水平下山羊草苗期各指标的变异表现Table 5 Variation of indexes in the seedling stage of different potassium treatment setting

表6 低钾条件下山羊草不同基因型各指标的相关系数矩阵Table 6 Correlation matrix of indexes of different Aegilops in low potassium treatment setting

2.3 山羊草苗期各生长指标的相关分析

将相对根冠比、相对根长、相对地上部干重、相对钾积累量和相对钾利用效率这5个指标进行相关分析(表6)，其中相对地上部干重与相对钾积累量呈极显著正相关(r= 0.875，N = 130，P<0.01)，与相对根冠比呈显著正相关(r= 0.224，N = 130，P<0.05)，相对钾积累量与相对钾利用效率呈极显著负相关(r= -0.321，N = 130，P<0.01)，相对根冠比与相对根长呈极显著正相关(r= 0.773，N=130，P<0.01)，说明地上部干重随钾积累量增大而增大。

2.4 山羊草苗期生长指标的主成分分析

与对照相比，低钾胁迫处理后的9种山羊草植株受到不同程度的影响。根据其相对指标(表5)，进行相关分析(表6)可以看出，9种山羊草的5个相对指标之间都存在一定的相关性，从而使得他们所提供的信息发生重叠，同时各指标在耐低钾中所起的作用也不尽相同。所以直接利用这些单个指标进行耐低钾评价具有片面性。

对9种山羊草的5个相对指标进行主成分分析，提取3个综合指标(表7)，其贡献率分别为41.34%，33.02%和20.53%，累积贡献率达94.89%。第一主成分包括相对地上干重和相对钾积累量；第二主成分包括相对根冠比和相对根长；第三主成分包括相对钾利用率。这样，把原来5个单项指标转换为3个新的相互独立的综合指标。

表7 各综合指标的系数及贡献率Table 7 Coefficient of comprehensive indicates and proportion

2.5 不同种类山羊草耐低钾基因型的鉴定结果

根据因子得分值，由公式(1)分别求出9种山羊草所有因子的隶属函数值U(x)(表7)。再根据3个综合指标贡献率大小，由公式(2)分别求出各综合指标的权重[19]。利用综合指标评价公式(3)求出综合评价值D。根据各综合指标的指标系数及各单项指标的相对值，分别计算出每种山羊草的3个综合指标的得分值C(x)(表8)。

综合评价值(D值)反映了各材料耐低钾能力的大小，数值越大，表明耐低钾胁迫能力越强。结果显示：双角山羊草、偏凸山羊草、粗厚山羊草、拟斯卑尔托山羊草、尾状山羊草、粘果山羊草、易变山羊草、欧山羊草、小伞山羊草的D值分别为0.383，0.898，0.327，0.516，0.007，0.682，0.338，0.346，0.655。由此可知，耐低钾胁迫能力强弱顺序为：偏凸山羊草>粘果山羊草>小伞山羊草>拟斯卑尔托山羊草>双角山羊草>欧山羊草>易变山羊草>粗厚山羊草>尾状山羊草。

表8 9种山羊草的公因子得分值C(x)、隶属函数值U(x)、综合评价值DTable 8 The values of component score C(x), subordinative function U(x) and comprehensive evaluation D of 9 different genotypes of Aegilops

3 讨论

隶属函数分析是一种在多指标测定的基础上对材料进行综合评价的方法，将其应用于植物耐低钾种质的的筛选，更具科学性和可靠性。植物体是一个统一的有机体，所测的生理指标可能性质相同或相互关联，如果使用单个指标来评价某种植物的耐低钾性质则会对结果造成偏差。山羊草耐低钾胁迫是一个复杂的、受多因素影响的数量性状。不同山羊草的耐低钾机制不尽相同，同时，不同山羊草对某一具体指标的耐低钾性质反映也不尽相同，因此，单一指标难以准确全面的反映其耐低钾性的强弱。本研究选用主成分分析法将原来个数较多的且彼此关系错综复杂的指标转换为新的、个数较少的且彼此独立的综合指标[23-25]。这些综合指标既能多方面的反映原生理指标的信息，又能将差异不十分明显的各个原指标的信息集中表现出来。之后，在综合指标的基础上，运用隶属函数法进行综合评价得到的结果更加可靠。

不同的试验方法得出的结论可能会有差异，本试验采用的方法为营养液培养，该方法的优点是培养过程容易控制，其他常用方法还有大田试验、盆栽试验等，但是这些方法很难控制单一元素的缺乏研究，对山羊草耐低钾种质筛选而言不可行，而采用营养液培养法更为简单有效，因此可以作为山羊草耐低钾种质筛选的首选方法[9, 26]。根据山羊草苗期生长的表型观察，仅有个别材料在低钾条件下表型与对照差异不明显，其余材料同对照相比均表现出茎短细弱，叶色暗淡且没有光泽，并出现倒伏。其病状首先出现在老叶上，表现为缺绿斑点，有些甚至呈烧焦状，呈现出明显的缺钾症状。这些特征与其他作物在低钾处理下的变化一致[27-29]。

通过对9种山羊草在低钾胁迫条件下相应指标的测定，利用隶属函数加权平均法，得到耐低钾性度量值(D值)。研究结果表明，偏凸山羊草的耐低钾能力最强，尾状山羊草耐低钾能力最弱。种质间耐低钾的差异具有可比性，同时也可根据需求将其划分为不同的耐低钾类型。这样，既考虑了各指标间的相互关系，又考虑到各指标的重要性，从而使得出的结论与实际结果较为接近。

小麦是我国主要粮食作物之一，在农业生产中占有重要的地位。随着社会的发展，小麦的产量越来越受到民众的关注。生产上，为了提高小麦产量，人们大量的施用钾肥，这不仅增加了生产成本，而且还加剧了钾矿资源的消耗。由于小麦耐低钾育种材料有限，因此通过育种方法直接选育可应用于生产的小麦耐低钾品种困难较大。因此本研究拟通过研究山羊草的耐低钾胁迫特性，筛选和鉴定出耐低钾山羊草种质(偏凸山羊草)，后续希望进一步研究其耐低钾胁迫抗性基因，并通过基因工程等手段将耐低钾胁迫抗性基因转入到小麦中，从而改善小麦耐低钾的性质，获得耐低钾的小麦育种材料，直接或间接培育耐低钾小麦品种。

4 结论

本研究以9种不同基因型山羊草为供试材料，采用改进的Hoagland培养液及砂培盆栽的方法，设低钾和正常供钾两个水平，地上部干重、钾积累量和钾利用效率可以作为苗期耐低钾种质筛选的重要指标；通过主成分分析将5个单项指标转化为3个相互独立的综合指标，并利用隶属函数法进行耐低钾性状综合评价，得出耐低钾强弱顺序为：偏凸山羊草>粘果山羊草>小伞山羊草>拟斯卑尔托山羊草>双角山羊草>欧山羊草>易变山羊草>粗厚山羊草>尾状山羊草，这与苗期表型观察结果基本相一致。本研究初步建立了山羊草耐低钾种质的评价指标，分析了9种山羊草的耐低钾特性，为进一步研究山羊草的耐低钾分子机制，以及育种上利用耐低钾山羊草种质提供了材料和理论依据。