赖跃平，陈建松，陈实

（厦门大学附属福州第二医院，福建福州350007）

人参养荣汤对颅脑外伤大鼠TGF-β1／Smad信号通路相关因子的干预实验研究

赖跃平，陈建松，陈实

（厦门大学附属福州第二医院，福建福州350007）

目的通过人参养荣汤干预大鼠颅脑外伤模型探讨TGF-β1／Smad信号通路在颅脑创伤发生后的作用。方法建立大鼠颅脑外伤模型后，分为正常组、模型对照组（只做开颅重物击伤）、实验组（开颅重物击伤＋人参养荣汤），采用HE染色大鼠脑组织，ELISA法检测血清中的Decorin、TGF-β1、Smad2、Smad3含量，Western Blot检测脑组织中的TGF-β1、Smad2、Smad3、TF蛋白含量。结果HE染色显示：模型对照组脑组织出现了较严重的皮质与海马神经细胞变性、丢失，实验组次之；正常组血清中Decorin的表达最高，实验组次之，模型对照组最低，各组比较均有显著性差异（P＜0.05）；TGF-β1、Smad2、Smad3、TF蛋白的表达，模型对照组最高，实验组次之，正常组最低，各组比较均有显著性差异（P＜0.05）。结论人参养荣汤能通过TGF-β1／Smad信号通路改善颅脑创伤。

颅脑外伤；大鼠；人参养荣汤；TGF-β1／Smad信号通路

颅脑外伤是常见的神经外科疾病，近年来随着经济、交通的发展，我国颅脑外伤发生率及因颅脑外伤致死致残的伤员逐年增加。有研究显示：颅脑损伤后的神经细胞损害及死亡主要是由于继发炎性反应所致［1］。在创伤后由于急性应激，体内短时间内会分泌大量的TGF-β1，而过多的TGF-β1沉积又加重局部炎性反应。Smad为TGF-β1的胞内信号传导蛋白，TGF-β1／Smad形成通路系统参与继发性炎性反应的调控［2］。人参养荣汤出自于《太平惠民和剂局方》，研究表明：人参养荣汤能够改善骨髓造血功能，对机体防御系统功能紊乱有修复作用，可抑制大脑皮质神经元密度的下降等，同时对颅脑损伤引起的炎症反应有明显抑制作用［3-4］。本研究拟建立大鼠颅脑外伤模型，采用人参养荣汤干预大鼠颅脑外伤模型，检测损伤后不同组别血清、脑组织中TGF-β1／Smad信号通路的关键因子，探讨人参养荣汤通过TGF-β1／Smad信号通路在颅脑创伤发生后的干预作用，探讨其治疗颅脑损伤可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物及药物3月龄SPF级SD雄性大鼠40只，上海西斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK（沪）2013-0002，合格证编号：2007 000562039，体重（350±20）g，饲养于福建医科大学动物实验中心鼠类实验室。药物制作方法：首先将人参、黄芪、白术、茯苓、当归、白芍、熟地黄、陈皮等干品等量混合，用75%乙醇回流提取2～3次，每次溶媒用量约为生药量的8～12倍，每次提取时间为1～2 h，合并提取液后浓缩至干，并进一步干燥，得人参养荣汤提取物。

1.1.2 分组及模型建立应用随机数字表法分组，每组10只，分为正常组、模型对照组（只做开颅重物击伤）、实验组（开颅重物击伤＋人参养荣汤），人参养荣汤提取液最佳浓度9 g／（kg·d）。正常组、模型对照组采用生理盐水灌胃，实验组采用人参养荣汤提取液灌胃。手术大鼠前3 d单独喂养，术前禁食8 h，实验时腹腔内注射水合氯醛进行麻醉，俯卧位固定于脑立体定向仪上。消毒皮肤，头部正中切开，剥离骨膜，暴露右顶骨，用牙科钻在冠状缝后、中线旁区域钻一直径5 mm骨窗，保持硬膜完整。将撞杆置于硬膜上，用祛码于一定高度沿外周导管坠落，撞击撞杆从而撞击硬膜，使脑组织产生瞬间形变，致顶叶脑挫裂伤，迅速将装置移开保证只有1次撞击。撞击后切口内滴注4万U硫酸庆大霉素4～5滴，骨蜡封闭骨窗，缝合头皮。

1.1.3 主要试剂与仪器TGF-β1、Smad2、Smad3、TF抗体（美国Santa Cruz公司）；WesternBreeze（美国Invitrogen公司）；PVDF膜（美国Amersham公司）；Decorin、TGF-β1、Smad2、Smad3酶联免疫吸附测试试剂盒（上海西唐生物科技有限公司）；石蜡切片机（CUT 4060型，德国Leica Biosystems公司）；OLYMPUS电子显微镜（日本TKO光学仪器株式会社产品）；HMIAS－2000显微图像分析系统（武汉千屏影象技术有限责任公司）；GEL DOC 2000凝胶成像系统（美国伯乐BIO-RAD公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 取材各组均于造模后连续干预30 d后取材。大鼠经腹腔注射10%水合氯醛麻醉，常规胸腹联合切口，经左心室插管，分别用生理盐水、多聚甲醛的磷酸盐缓冲液灌注，注毕取出大脑放人4%多聚甲醛溶液内，4℃固定48 h后样本切片，作尼氏体染色。腹主动脉取血，离心，取血清，冷冻、待检。

1.2.2 ELISA法检测血清中的Decorin、TGF-β1、Smad2、Smad3含量取各组血清，按要求分别加入样品、稀释液、标准品各50 μL，37℃30 min温育。再加入酶标偶合液洗板，加入底物反应15 min后加入终止液，酶标仪450 nm处读取OD值。

1.2.3 Western Blot检测脑组织中的TGF-β1、Smad2、Smad3、TF蛋白的含量各组脑组织低温充分匀浆后，用Bradford法进行蛋白定量；取20 μg蛋白样品，10%SDS-PAGE电泳，100 V转移1 h至硝酸纤维素薄膜，放入封闭液中37℃封闭1 h；一抗（TGF-β1、Smad2、Smad3、TF）4℃过夜；同时，另1张用不含抗体TBS-T液孵育，作为阴性对照；反复洗膜后，将膜与碱性磷酸酶（AP）标记的抗IgG抗体孵育，室温轻摇1 h；洗膜后，用Western Blot印迹观察，用图像分析测定各带吸光度（A）值做定量分析。

1.3 统计学方法运用SPSS 18.0软件包进行数据分析。计量资料属正态分布用（x±s）表示，采用多组间单因素方差分析方法（F检验）。

图1 正常组脑组织尼氏体染色结果（×400）

图2 实验组脑组织尼氏体染色结果（×400）

图3 模型对照组脑组织尼氏体染色结果（×400）

表1 3组血清中Decorin、TGF-β1、Smad2、Smad3含量变化

2 结果

2.1 各组大鼠脑组织尼氏体染色结果正常组尼氏体为细颗粒；模型对照组尼氏体为细尘状颗粒，胞浆着色浅，胞体肿胀，细胞变为圆形，胞核移至位于轴突起始部对侧边缘部；而实验组仍可见部分正常尼氏体。见图1～图3。

2.23 组血清中Decorin、TGF-β1、Smad2、Smad3含量比较见表1。

2.33 组脑组织中TGF-β1、Smad2、Smad3、TF蛋白表达比较见表2、图4。

3 讨论

颅脑损伤后的继发的炎性反应常常导致神经细胞的损害及死亡［5］。创伤后应激促进体内炎症介质刺激组织因子（tissue factor，TF）大量分泌，激活外源性凝血途径，激发整个凝血过程，进一步加剧神经细胞的损害［6－7］。正常生理状态下，血浆中TF水平表达非常低，血液中的单核细胞和接触血浆的血管内皮细胞不表达TF，而在创伤应激情况下，血浆中的TF活性可增加至14倍［8］。有研究发现：若颅脑外伤患者入院时TF大量表达，则其凝血功能就存在异常，则有很大概率发生继发性脑损伤，TF对凝血功能异常程度及判断脑组织受损程度和评估预后具有重要价值［9］。本研究结果显示模型对照组中TF蛋白表达最高，正常组最低，与此观点一致。

脑组织中的星形细胞、神经元、少突细胞、小胶质细胞等细胞都能产生TGF-β1，病理状态下TGF-β1可在脑组织中大量表达，并可促进神经细胞的增殖、细胞外基质的形成以及促进颅脑损伤后的组织修复［10］。Smad蛋白质群是一类细胞内信号传导蛋白，参与TGF家族成员的信号传导，Smad2和Smad3是激活TGF-βs信号通路的作用底物，在细胞核中直接地应答TGF-β的转录功能［11］。

当脑损伤发生后，脑组织中大量表达TGF-β1，并激活具有丝氨酸、苏氨酸激酶活性的TGF-β受体，活化后的受体进一步激活Smad2和Smad3等蛋白，使其发生丝氨酸磷酸化，磷酸化后的Smads蛋白聚集形成复合物后进入细胞核，与特异性的DNA连接蛋白结合，最后影响脑组织中神经细胞的分化。Decorin是一种普遍存在于细胞外基质的富含亮氨酸的小分子蛋白多糖，是TGF-β最重要的负调节剂，能降低TGF-β生物学活性［12］。本研究结果显示：当颅脑外伤发生后，大鼠体内TF大量分泌，血液中的炎症介质向脑损伤区聚集，释放TGF-β1使血细胞或免疫细胞产生的TGF-β1进入脑损伤区，同时激活TGF-β1／Smad信号通路，表现为模型对照组血清中TGF-β1、Smad2、Smad3含量最高，正常组最低；Decorin的表达与之相反，正常组最高，模型对照组最低；而脑组织中TGF-β1、Smad2、Smad3、TF蛋白表达趋势也与血清中一致。表明TGF-β1／Smad信号通路与颅脑创伤诊断及损伤程度的判断关系密切，TGF-β1信号因子可作为颅脑创伤的诊断、治疗、预后的判断指标。

我国传统医学认为颅脑损伤的病机为外力撞击脑部，导致脉络破损，气机逆乱，离经之血瘀阻于清窍；瘀阻气滞而化痰，痰瘀互阻而蒙窍，导致而清阳不升，浊阴不降，至元神失主，神机失用而昏厥。人参养荣汤由人参、白芍、黄芪、茯苓、白术、熟地黄、当归、陈皮等十几味中药组成，具有扶正固本，改善机体内环境，增强和调动机体自身抗病能力从而减低并发症发生率。有实验研究表明：人参养荣汤中含皂甙、糖类、氨基酸、维生素等多种成分，具有辅佐细胞存在下改善造血功能；刺激单核细胞活性；可促进脾集落生成单位的增加及成红细胞系的恢复，继而刺激CSF的产生，促进淋巴细胞、单核细胞、粒细胞的分化，刺激IL-6的生成等作用，修复机体防御系统功能，提高抗应激能力及抗疲劳的作用［13-16］。本实验结果显示：采用人参养荣汤干预大鼠颅脑外伤模型后血清与蛋白的Decorin、TGF-β1、Smad2、Smad3、TF均较模型对照组有所升高，表明人参养荣汤能通过TGF-β1／Smad信号通路改善外伤后颅脑的损伤程度。

表2 3组脑组织中TGF-β1、Smad2、Smad3、TF蛋白表达比较

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R285.5

A

1000-338X（2017）04-0027-03

2017-04-08

福州市科技资助项目（2014-S-137-9）

赖跃平（1963—），男，主任医师，主要从事神经外科临床工作。