钟会清， 张 武， 侯雨晴， 苏成康， 刘智明， 姜雪梅， 郭周义*, 刘宁湘

(1. 华南师范大学生物光子学研究院，国家中医药管理局中医药与光子技术三级实验室，广州 510631；2. 暨南大学附属第一医院,广州 510632)

基于拉曼光谱对人舌鳞癌动物模型的建立与检测

钟会清1， 张 武2， 侯雨晴1， 苏成康1， 刘智明1， 姜雪梅1， 郭周义1*, 刘宁湘2

(1. 华南师范大学生物光子学研究院，国家中医药管理局中医药与光子技术三级实验室，广州 510631；2. 暨南大学附属第一医院,广州 510632)

建立人舌鳞癌细胞体外癌变模型, 采用激光共焦显微拉曼光谱仪对其进行检测,从分子层面对其进行分析. 通过培养CAL-27细胞，然后注射在裸鼠皮下成瘤，采用激光共焦显微拉曼光谱仪和苏木精-伊红(HE)染色法观察其癌变的情况. 结果表明，正常皮肤组织的切片清晰可见，其细胞层次清晰、整齐，但是肿瘤组织发现上皮异常增生，细胞多形性，结构层次非常不清楚；采用共焦显微拉曼光谱技术，结合主成分分析法和线性判别技术对健康裸鼠和人舌鳞癌细胞体外癌变组织进行分类，其得到诊断灵敏度为98.3%，特异性为95.0%，诊断正确率为96.7%. 该方法可以很好地对该动物模型进行在体的检测.

激光共焦显微拉曼光谱仪； 人舌鳞癌细胞； HE染色； 主成分分析法； 线性判别技术

舌癌的发病率位居头颈部恶性肿瘤之首，且有逐年上升的趋势，易发于男性，发病年龄在40～60岁居多，但近年来有女性增多及发病年龄年轻化的趋势，尽管医学工作者及研究人员在不断努力，而舌癌Ⅰ期的早期诊断病例仅占10.9%～25.4%，其5年存活率仍一直徘徊在50%～60%左右[1-4]. 但其发生发展机制至今仍不清楚， 在一定程度上限制了舌癌预防、诊断和治疗水平的进一步提高[5]. 同时建立舌癌体外动物模型则是研究发生发展机制必需的实验平台[6]. 之前研究者主要采用苏木精-伊红(HE)染色法观察动物模型组织的形态变化来研究舌癌的机制问题， 该方法准确率相对高，但是繁琐、工作量大、有创伤、不能进行实时监测. 拉曼光谱属于分子振动谱，由于不同分子的化学键或官能团具有不同的振动能级，所以可以通过分子振动和转动能级差的特征频移得到分子结构或成分的信息. 因此，拉曼光谱具有分子指纹特征，能从分子水平上探测组织细胞内的蛋白、核酸、脂类、糖类等生物分子的精细结构和信息，它是研究分子结构和功能的有效方法之一，具有快速、简单、无损、准确等优点[7-8]. 目前，拉曼光谱已被广泛应用于人体组织(皮肤、乳腺、胃、肺等)和体液(血清、血浆、尿液、唾液、眼泪和精液等)的检测，常被用于疾病的诊断，特别是癌症早期的检测与诊断的研究[9-16]. 本文采用激光共焦显微拉曼光谱对人舌鳞癌细胞体外癌变模型进行在体检测，从而为进一步研究舌癌发生发展机制提供一个更好方法.

1 研究方法

1.1 主要试剂与仪器

DMEM细胞培养基粉末(高糖)GIBCO (Grand Island, NY, United States)、胚牛血清(FBS)和胰蛋白酶(含0.25%EDTA)(天津TBD生物试剂公司). BALB/C-nu/nu裸鼠(中山大学动物中心提供，4周龄，雌雄兼用. 本文动物实验已向华南师范大学伦理委员会备案并获批.)、人舌鳞癌细胞CAL-27(上海瑞鹿生物科技有限公司).

Renishaw inVia型共聚焦显微拉曼光谱系统(英国雷尼绍贸易有限公司).

1.2 实验方法

1.2.1 人舌鳞癌细胞(CAL-27)培养及体外人舌鳞癌细胞模型的建立 细胞培养方式：10%小牛血清的DMEM(高糖)培养液，于37 ℃ CO2恒温培养箱内常规培养. 取对数增值期贴壁生长的人舌鳞癌CAL-27细胞，消化后，再将DMEM(高糖)培养液冲洗、吹打、离心. 所有动物随机分2组(空白对照组和模型组)，每组60只. 空白对照组不进行任何处理，但模型组按照35 μg/g体质量腹腔注射1.25%戊巴比妥钠麻醉BALB/C-nu/nu裸鼠，将细胞悬液(4×1010个/孔， 0.05 mL)注入裸鼠背部皮下，再将动物放入动物培养箱里继续饲养，每天对其进行观察，15 d后在接种位置发现一个透明的小包.

1.2.2 形态学观察 在裸鼠接种15 d后且经过拉曼光谱扫描之后，处死裸鼠，将接种位置的皮肤取下，计算成瘤率，并将标本放入含有10%中性甲醛的棕色瓶中固定，然后按照常规石蜡包埋、切片、HE染色、光学显微镜下观察.1.2.3 激光共焦显微拉曼光谱的检测及数据处理 使用显微共焦拉曼光谱仪,光谱测量范围600～1 800 cm-1，光谱分辨率约1 cm-1，激发光源为785 nm半导体激光，样品上的激发功率约为0.5 mW，激光光斑直径为5 μm. 仪器配套的显微镜为莱卡DM2500，物镜放大倍数50×. 每条谱线累计测量2次，每次10 s. 每个样品在不同位点测量3次，然后取平均谱. 所有谱线都在相同条件下测量，光谱的获取与分析均使用拉曼软件包WIRE 3.2.

为了去除拉曼谱线背景噪声，采用五阶多项式拟合背景曲线后从原始谱线中扣除. 为了便于比较不同样品光谱形状和谱峰的相对强度，对曲线下的光谱面积进行归一化处理. 光谱的平滑和基线修正采用Vancouver拉曼算法,Vancouver是一个能进行批处理的扣除荧光背景噪声和曲线平滑的算法.

2 结果与讨论

2.1 肿瘤组织形态学

在裸鼠左后背部皮肤接种后，再让动物继续在动物房饲养并观察(图1)，正常裸鼠皮肤组织结构层次清晰(图1A)，能明显区分角质层、表皮层、真皮层，但是在接种后15 d后，可观察到一个透明的小胞(图1B)，接种组肿瘤组织结构层次混乱，难以区分各层. 从该图可见造模成功. 空白对照组和模型组的裸鼠在拉曼检测之后，采用麻醉药麻醉后取小胞及其周围组织以及正常裸鼠该位置的皮肤进行病理组织切片实验.

图1 空白对照组与CAL-27细胞接种组的照片及其HE染色病理切片图(100×)

Figure 1 The photo and HE photo of control group and CAL-27 cell vaccination group (100×)

2.2 皮肤组织与肿瘤组织在体检测的拉曼光谱

对120只裸鼠进行检测，最后得到的光谱用于主成分和线性判别分析. 图2显示了肿瘤裸鼠和健康裸鼠皮肤的平均谱及差谱. 在健康皮肤与肿瘤皮肤的谱中，主要的拉曼峰有751、831、854、940、1 004、1 032、1 086、1 129、1 159、1 208、1 341、1 451、1 557、1 657 cm-1，详细的谱峰归属见表1. 从图2中差谱发现在1 004、1 451、1 657 cm-1处肿瘤皮肤相对健康皮肤的峰要强[17]，但是在751 cm-1的位置其相对健康皮肤要弱.

图2 正常皮肤组织与肿瘤组织的平均谱及差谱

Figure 2 Average Raman spectra of cancer tissue from nude mouse, normal tissue, and cancer-normal difference spectra

表1 舌癌动物模型皮肤接种的拉曼光谱归属

Table 1 Tentative assignments of major vibrational modes identified in carcinoma of the tongue model skin of nude mouse

峰位置/cm-1归属751色氨酸的对称呼吸模型831酪氨酸O—P—O伸缩模型854酪氨酸和脯氨酸环C—C伸缩呼吸模型940胶原蛋白的C—C骨骼α螺旋缬氨酸1004苯丙氨酸的对称呼吸振动模型1032苯丙氨酸C—H对称伸缩模型1086蛋白C—N伸缩模型1129脂类C—C伸缩模型1159蛋白C—C/C—N伸缩模型1208蛋白质色氨酸、丙氨酸的C—C6H5伸缩振动模型1341胶原蛋白和核苷酸链CH3CH2摇摆模型1451蛋白和脂类CH3CH2变形振动模型1557色氨酸1657角蛋白AmideICC伸缩模型

采用主成分析法来区分正常组织和癌变组织. 通过正交变换，数据集中的变量极大减少而所包含的信息没有损失. 该研究主要采用主成分分析用于处理拉曼光谱，并取主要贡献的主成分1(PC1)和主成分2(PC2)作散点图(图3). 采用主成分分析法分析其前2个成分的散点图可区分健康皮肤和肿瘤皮肤.

图3 裸鼠正常皮肤组织和肿瘤组织拉曼光谱经PCA主成分分析的散点图

Figure 3 Scatter plot of PCA result for normal and cancer groups with PC1 and PC2 as two axes

将人舌鳞癌细胞接种于裸鼠皮肤上，采用主成分分析法和线性判别分析技术搜索肿瘤组织病理特征拉曼光谱. 利用主成分分析法结合留一交叉检验法，绘制裸鼠皮肤正常组织与肿瘤组织拉曼光谱的线性判别得分散点图(图4)，分界线产生的诊断灵敏度为98.3%(59/60)，特异性为95.0%(57/60)，总诊断准确率为96.7%(116/120). 从上述结果说明利用主成分分析法结合线性判别分析技术可为人舌鳞癌细胞接种于裸鼠皮肤上肿瘤的快速无创诊断发展了一条新的途径.

图4 正常皮肤组织与肿瘤组织采用主成分分析和线性判别得分散点图

Figure 4 Scatter plot of the linear discriminant scores of normal skin and skin of carcinoma of the tongue of animal model using PCA-LDA

为了进一步验证构建的PCA-LDA算法的有效性，采用工作特征(Receiver Operating Characteristic,ROC)曲线方法来评价该算法. ROC曲线越靠近左上角，判别的准确性就越高，最靠近左上角的点是错误最少的最好阈值，其假阳性和假阴性的总数最少. ROC曲线下的面积与诊断准确性紧密相关，处于ROC下方的面积(Area Under ROC Curve, AUC)越接近于1，说明诊断效果越好. 对PCA-LDA诊断模型所得判别函数得分进行分析得到ROC曲线(图5), 该ROC曲线下的面积为0.983，说明本文提出后方法具有较高准确性，该结果进一步验证了PCA-LDA算法的诊断能力.

图5 PCA-LDA算法的被试工作特性曲线

Figure 5 Receiver operating characteristic curve of PCA-LDA algorithm

3 结论

提出一种高效的人舌鳞癌细胞体外动物癌变的拉曼光谱诊断模型，该模型是通过主成分分析法和线性辨别分析技术挑选与生化成分相关的特征拉曼带. 利用该模型获得了较高的总诊断准确率、灵敏度和特异性. 相对于HE染色方法具有无创伤、可在体检测等优点. 结果表明，拉曼光谱结合主成分分析法和线性判别技术在无创伤探测和诊断人舌鳞癌体外动物模型方面有巨大的潜力，为研究舌癌发生发展机制提供有效的途径.

[1] LI Y, JOHN M S, ZHOU X,et al. Salivary transcriptome diagnostics for oral cancer detection[J]. Clinical Cancer Research,2004,10(24):8442-8450.

[2] PALMER M. Cancer statistics[J]. British Journal of Cancer,1980,41(6):1006-1007.

[3] MOCHIZUKI Y,HARADA H,IKUTA M,et al. Clinical characteristics of multiple primary carcinomas of the oral cavity[J]. Oral Oncology,2015,51(2):182-189.

[4] 朱李军,丁学强,陈宇,等. 舌癌阴性淋巴结的微转移与临床病理及预后的相关分析[J]. 中国口腔颌面外科杂志,2006,4(5): 341-344.

ZHU L J,DING X Q,CHEN Y, et al. Correlation analysis of micrometastases and clinicopathological factors and prognosis in tongue cancer with histopathological negative lymph nodes[J]. China Journal of Oral & Maxillofacial Surgery,2006,4(5): 341-344.

[5] DRESSELHUIS D M,STUART M A C,AKEN G A V,et al. Fat retention at the tongue and the role of saliva: adhesion and spreading of ‘protein-poor’ versus ‘protein-rich’ emulsions[J]. Journal of Colloid and Interface Science,2008,321(1):21-29.

[6] 杨宏宇,李金荣,胡传真,等. 人舌鳞癌裸鼠原位移植模型及其主要生物学特性的研究 [J]. 中华口腔医学杂志,1998,33(2):73-75.

[7] THOMAS G J. Raman spectroscopy of protein and nucleic acid assemblies[J]. Annual Review of Biophysics & Biomolecular Structure,1999,28(28):1-27.

[8] DURAIPANDIAN S,ZHENG W,NG J,et al.Invivodiagnosis of cervical precancer using Raman spectroscopy and genetic algorithm techniques[J]. Analyst,2011,136(20):4328-4336.

[9] HUANG Z,BERGHOLT M S,ZHENG W,et al.Invivoearly diagnosis of gastric dysplasia using narrow-band image-guided Raman endoscopy[J]. Journal of Biomedical Optics,2010,15(3):037017.

[10]CASPERS P J,LUCASSEN G W,CARTER E A,et al.Invivoconfocal Raman microspectroscopy of the skin: noninvasive determination of molecular concentration profiles[J]. Journal of Investigative Dermatology,2001,116(3):434-442.

[11]CHEN Y J,CHEN R,LI Y Z,et al. Raman spectral analysis of theanine[J]. Spectroscopy and Spectral Analysis,2011,31(11):2961-2964.

[12]SUN L,SUNG K B,DENTINGER C,et al. Composite organic-inorganic nanoparticles as Raman labels for tissue analysis[J]. Nano Letters,2007,7(2):351-356.

[13]FENG S Y,LIN J Q,CHENG M,et al. Gold nanoparticle based surface-enhanced Raman scattering spectroscopy of cancerous and normal nasopharyngeal tissues under near-infrared laser excitation[J]. Applied Spectroscopy,2009,63(10):1089-1094.

[14]LIN D,CHEN G N,FENG S Y,et al. Development of a rapid macro-Raman spectroscopy system for nasopharyngeal cancer detection based on surface-enhanced Raman spectroscopy[J]. Applied Physics Letters,2015,106(1):013701.

[15]LIN J Q,CHEN R,FENG S Y,et al. A novel blood plasma analysis technique combining membrane electrophoresis with silver nanoparticle-based SERS spectroscopy for potential applications in noninvasive cancer detection[J]. Nanomedicine Nanotechnology Biology & Medicine,2011,7(5):655-663.

[16]LI S X,LI L F,ZENG Q Y,et al. Characterization and noninvasive diagnosis of bladder cancer with serum surface enhanced Raman spectroscopy and genetic algorithms[J]. Scientific Reports,2015,5:9582.

[17]BERGHOLT M S,ZHENG W,LIN K,et al.Invivodiagnosis of esophageal cancer using image-guided Raman endoscopy and biomolecular modeling[J]. Technology in Cancer Research & Treatment,2011,10(2):103-112.

【中文责编：谭春林 英文审校：肖菁】

Establishment and Detectionof a Carcinogenesis Model of Human Squamous Tongue Cancer Based on Raman Spectrometer

ZHONG Huiqing1, ZHANG Wu2, HOU Yuqing1, SU Chengkang1, LIU Zhiming1, JIANG Xuemei1, GUO Zhouyi1*, LIU Ningxiang2

(1. SATCM Third Grade Laboratory of Chinese Medicine and Photonics Technology, College of Biophotonics, South China Normal University, Guangzhou 510631, China; 2. The First Affiliated Hospital of Jinan University, Jinan University, Guangzhou 510632, China)

The aim of this paper is to establish a carcinogenesis model of human squamous tongue cancer cell in vitro. The model is tested by laser confocal micro Raman spectrometer and is analyzed from the molecular level. The CAL-27 cells are cultivated, and injected subcutaneously in nude mice into a tumor, then using laser confocal micro Raman spectrometer and Hematoxylin-eosin (HE) staining, the canceration is obtained. From the normal skin tissue slice, it can be seen that the cellular level is clear and neat. But it can be found that the tumor epithelial dysplasia is cellular pleomorphism and the structure level is not clear. After laser confocal micro Raman spectrometer observing, the principal components analysis (PCA) combination with linear discrimination analysis (LDA) are used to classify the health nude mice and human tongue squamous cancer cells in vitro tumor tissue. It can be obtained the diagnostic sensitivity of 98.3%, specificity of 95.0% and accuracies of 96.7%. It is shown that this method is very good for detecting the animal modelinvivo.

laser confocal micro Raman spectrometer; human squamous tongue cancer cell; HE staining; principal components analysis (PCA); linear discrimination analysis(LDA)

2017-03-20 《华南师范大学学报(自然科学版)》网址：http://journal.scnu.edu.cn/n

国家自然科学基金项目 (31300691，61675072，21505047，61335011，11404116)；教育部高等学校博士学科点专项科研基金项目 (20134407120003)；广东省科技计划项目(2014A020212282)；广东省自然科学基金重点项目 (9251063101000009)；广东省重大科技专项项目 (2012A080203008)；广东省教育厅科技创新项目 (2013KJCX0052)

O433.1,R739.86

A

1000-5463(2017)04-0001-04

*通讯作者:郭周义,教授，Email: ann@scnu.edu.cn.