吴凡+赵蓓蓓+王浩

摘要：以紫霞黄栌（Cotinus coggygria var. ‘Zixia）为材料，组培紫霞黄栌外植体，获得最适宜紫霞黄栌的组培条件，得到一套紫霞黄栌苗木资源大规模生产的组织培养技术规范。最适宜的诱导分化培养基为MS基础培养基添加1.0 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA，扦插苗、一年生枝条和二年生枝条作为外植体的诱导率分别达到96.7%、93.3%和73.3%。外植體材料在5～8月适宜采集。增殖培养最适宜条件为以改良MS培养基作为基础培养基，pH调至5.4，添加100 μmol/L 6-BA、1 μmol/L NAA、10 μmol/L IAA并添加1 mg/L维生素C，评价得分4.23分，增殖系数最高达到8.97。生根培养使用MS改良培养基，添加0.3 mg/L IBA和0.2 mg/L NAA时生根率达到53%。移栽以消毒灭菌后的珍珠岩作为基质，温度控制为25 ℃，相对湿度保持在90%，移栽后组培苗成活率达到70%。使用该方法可大幅提高紫霞黄栌增殖数量。

关键词：紫霞黄栌（Cotinus coggygria var. ‘Zixia）；组织培养；改良MS培养基

中图分类号：Q943.1；S687 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）15-2942-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.15.036

Abstract： Continus coggygria var. ‘Zixia was used as the material to cultivate the explants of ‘Zixia through tissue culture. Aim to obtain the optimum culture condition of ‘Zixia and study the key technology of tissue culture and rapid propagation for ‘Zixia，in order to get a set of large-scale production of ‘Zixia seedling tissue culture technical specifications. The optimum inducing differentiation medium was MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA，the sprouting rate of cutting seedling，annual branches and biennial branches were 96.7%， 93.3% and 73.3% respectively. The suitable time for obtained explants were May to August. The optimum conditions for the proliferation culture were as follows：us modified MS medium，the pH was adjusted to 5.4， add 100 μmol/L 6-BA，1 μmol/L NAA， 10 μmol/L IAA， and 1 mg/L VC. The score was 4.23 and the proliferation coefficient reached 8.97. In the rooting culture stage was use modified MS medium，add with 0.3 mg/L IBA and 0.2 mg/L NAA， the rooting rate was 53%. During the transplanting stage， the perlite with sterile was used as the substrate，the temperature of greenhouse was controlled at 25 ℃，the relative humidity was kept at 90%，and the survival rate of plantlet was 70%. The use of this method can greatly improve proliferation of Cotinus coggygria var. ‘Zixia.

Key words： Continus coggygria var. ‘Zixia； tissue culture； modified MS medium

紫霞黄栌（Cotinus coggygria var. ‘Zixia）是漆树科（Anacardiaceae）黄栌属（Cotinus spp.）落叶小乔木或灌木。紫霞黄栌品种是黄栌的实生苗中发现的变异株，其当年生嫩芽、叶片和枝条在整个生长季呈紫红色，并保留了黄栌树种耐寒、耐旱、耐瘠薄和耐碱性土壤的生长特性[1]，当年苗高可达1 m左右，可运用于园林工程进行块状和带状种植，其长大成苗后可在庭院中孤植，也可在绿地中群植。紫霞黄栌观赏性佳，环境适应性强，应用范围广泛，其景观效果壮观，是良好的具有北京市绿化植物潜力的彩叶树种资源[2]。然而，紫霞黄栌作为黄栌的变异株，苗木数量少，扦插繁殖成活率低，从而大大限制了其生产效率。

组织培养是良种苗木快速繁育的有效途径[3]。张永红[4]、李彧[5]、苗青等[6]都对黄栌属或漆树科植物进行过组培研究报道。但是通过实践探究发现，黄栌和美国红栌的组织培养技术并不完全适用于紫霞黄栌的扩繁增殖，主要存在问题有外植体消毒困难、污染率高、增殖阶段增殖系数低、褐化现象严重、继代培养困难、生根阶段生根率低[7-11]。国内鲜见对紫霞黄栌进行组织培养方式快繁的研究，本研究通过探究消毒方法、培养基配方和生长调节剂对紫霞黄栌外植体组织培养的影响，旨在筛选出一整套最适宜紫霞黄栌外植体组织培养的条件，提高其快繁效率，为北京市提供大量优质的彩叶绿化资源。endprint

1 材料与方法

1.1 材料

紫霞黄栌苗木材料由北京市黄垡苗圃提供，分别剪取生长健康、长势良好的成年植株上的一年生嫩枝、芽和二年生硬枝作为材料。获得紫霞黄栌无菌外植体的方法：实生苗一年生枝条和二年生枝条均使用75%乙醇灭菌30 s后用无菌水冲净，HgCl2处理8 min。组培室培养条件均为温度25 ℃，光照时间16 h/d，光照度2 000 lx。

1.2 药品和设备

6-BA、NAA、IAA、2，4-D等药品采购于Sigma aldrich公司；SW-CJ-2D超净工作台，苏州智净净化设备公司；YS-CZ-DD单人超净工作台、YS-LED-18照明灯管：易生石木（北京）生物科技有限公司。SYQ-DSX-280A高温高压灭菌锅：上海申安医疗器械厂。PLT-250培养瓶：济南普朗特生物科技公司。

1.3 试验方法

1.3.1 诱导分化培养基设计 诱导分化培养基采用MS基础培养基，分别选取1.0、1.5、2.0 mg/L 6-BA，0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L NAA，采用双因素随机区组试验设计法（表1），添加30 mg/L蔗糖，6 g/L琼脂并将pH调至5.7，将灭菌后的外植体材料接入诱导分化培养基，每个处理接10个外植体，平行重复3次。

1.3.2 继代增殖培养基础培养基选择 将诱导分化后的外植体分别接入DKW、WPM、MS、1/2 MS、MS改良基础培养基，并添加1.0 mg/L 6-BA、0.1 mg/L NAA、30 g/L蔗糖、6 g/L琼脂，pH調至5.7，每个处理接10个外植体，平行重复3次。

1.3.3 培养基pH对外植体增殖的影响 选用改良MS培养基作为基础培养基，添加1.0 mg/L 6-BA，0.1 mg/L NAA，30 g/L蔗糖，6 g/L琼脂，pH分别调至4.5、4.8、5.1、5.4、5.7、6.0。

1.3.4 继代培养基添加不同植物生长调节剂正交试验 根据正交试验设计表[12]设计四因素四水平正交试验，分别选取0、1、10、100 μmol/L 4种浓度水平的6-BA、NAA、IAA、2，4-D 4种植物生长调节剂。将紫霞黄栌无菌外植体茎段接入MS改良培养基，并按照表1添加不同浓度生长调节剂，30 g/L蔗糖，琼脂6 g/L，调节pH至5.6～5.8。每瓶接种1个茎段，每个处理共接10个外植体，平行重复3次。

1.3.5 生根培养基设计 将长势良好的紫霞黄栌外植体转入MS改良培养基中，添加30 g/L蔗糖，6 g/L琼脂，pH调至5.4，然后分别添加0.1、0.2 mg/L NAA，0.1、0.2、0 mg/L IBA进行双因素随机区组生根培养试验，每个处理接10个外植体，平行重复3次。培养30 d对比生根情况。

1.3.6 生根苗移栽 取出生根的紫霞黄栌组培苗，洗净培养基，栽入营养钵中，基质为珍珠岩，生根苗温室温度控制在25 ℃，空气相对湿度90%，移栽后30 d统计成活率。

1.4 统计与分析

外植体分化培养，组培苗增殖培养和生根培养每3 d定时进行观察统计，测定其出芽率、增殖系数和生根率。分别于培养后15 d和30 d时统计生长状况。

污染率=（污染株数/接种总数）×100%

成活率=（成活个数/接种总数）×100%（受污染的外植体视为死亡）

出芽率=（出芽株数/接种总数）×100%

增殖系数=（试验后丛生芽数量/试验前丛生芽数量）×100%

1.5 数据分析方法

试验数据分析采用IMB SPSS Statistics 19软件进行单因素方差分析[13]；正交试验数据采用Minitab 17软件进行正交试验数据分析[14]。

2 结果与分析

2.1 不同浓度NAA、6-BA对外植体丛生芽诱导的影响

使用紫霞黄栌一年生嫩枝作为外植体时，诱导培养结果如图1所示。对照组诱导率为13.33%，说明一年生嫩枝材料适宜诱导培养。但添加植物生长调节剂后大部分处理诱导效果均没有扦插苗作为外植体时诱导率高。仅1号处理添加1.0 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA时诱导率高，达到93.33%。2号、3号、6号、7号、11号和12号处理诱导率较高，分别达到63.3%、60.0%、56.7%、70.0%、63.3%和66.7%。

使用紫霞黄栌二年生硬枝作为诱导材料时，结果如图2所示。对照组诱导率为0，不能诱导出芽。所有处理的效果均不如使用扦插苗或一年生嫩枝作为材料，1号处理诱导率最高，达到73.33%。

2.2 继代增殖培养基础培养基选择

不同增殖培养基接种紫霞黄栌外植体培养试验结果如图3所示，在使用不同培养基对紫霞黄栌外植体进行诱导时，增殖效果由好至坏依次为MS改良培养基、1/2 MS培养基、MS培养基、WPM培养基和DKW培养基，增殖系数分别为6.27、3.94、2.38、0和0。

2.3 培养基pH对组培苗增殖的影响

不同pH培养基接种紫霞黄栌外植体进行培养，试验结果如图4所示，pH由4.8～6.0逐渐升高的过程中，外植体培养的评价得分呈先升高再降低的趋势。其中，在pH为5.4时增殖系数达到4.7。

2.4 继代培养基添加不同植物生长调节剂的正交试验

由图5可知，1号处理4种植物生长调节剂浓度均为0，作为对照组，增殖系数为0。培养15 d后增殖效果最好的是14号处理，增殖系数8.97，组间偏差小，并且组培苗茎伸长明显，长势良好；8号和10号处理结果次之，增殖系数分别为5.47和5.50，同样茎部伸长明显；2号、6号、7号和13号处理增殖系数分别为3.33、4.50、4.72和3.89，其中的外植体产生大量愈伤组织，并在愈伤组织上产生不定芽，但是芽并不能向上伸长；11号、12号、15号和16号的增殖系数分别为2.33、3.85、2.67和4.16，组间差异较大，外植体生长状态不稳定；3号、4号、5号、9号试验处理效果差，组培苗死亡较多，愈伤组织不明显，不能增殖。endprint

利用Minitab进行方差分析多重比较，结果见表3。从表3可以看出，在α=0.05水平下，4种植物生长调节剂对紫霞黄栌外植体增殖影响的大小顺序为NAA>6-BA>2，4-D>IAA，相比较IAA，其余3种植物生长调节剂对紫霞黄栌外植体的增殖具有显著影响。

从图6的极差分析多重比较中发现，6-BA浓度在100 μmol/L、NAA浓度为1 μmol/L、IAA在浓度为10 μmol/L时处理效果最好。2，4-D的4种浓度处理中，0 μmol/L即不添加2，4-D时效果最好，随着2，4-D浓度增大，极差逐渐下降并且趋势明显，虽然2，4-D对外植体增殖有显著影响，但是其对于紫霞黄栌组培苗生长起负面作用。

2.5 生根培养结果

如图7所示，使用MS改良培养基作为基础培养基，不添加IBA、NAA时，生根率为0。在NAA分别为0.1、0.2 mg/L时，随着IBA从0.1、0.2、0.3 mg/L逐渐升高，生根率也逐渐升高；在添加0.2 mg/L NAA、0.3 mg/L IBA时生根率最高，达到53%。

2.6 生根苗的驯化移栽

将已生根的紫霞黄栌组培苗从培养瓶中取出，洗净残留琼脂，移栽至玻璃温室的营养钵中，以消毒灭菌后的珍珠岩作为基质，温室内25 ℃，相对湿度保持在90%。30 d后观察其成活情况，成活率达到70%。健壮的组培苗易于成活并且能长出新叶。

3 讨论与结论

3.1 讨论

诱导分化阶段无论是一年生嫩枝、芽还是二年生硬枝都使用MS基础培养基添加1.0 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA，并取得了较好的诱导效果。相比较而言，扦插苗的整体诱导率高于一年生嫩枝和二年生硬枝，随着6-BA和NAA浓度的逐渐升高，反而对其诱导产生了抑制作用。可以推测低浓度的NAA在新生芽诱导中起调控作用，高浓度的NAA对新生芽诱导的抑制性较强。

在增殖培养基的选择试验中发现WPM和DKW不适用于紫霞黄栌的组织培养，这可能是由于其中微量元素比例不合适。在以往的黄栌和美国红栌组培试验中都使用MS培养基作为基础培养基[15-17]，MS培养基适宜于大部分外植体的组培，但是对于紫霞黄栌的增殖效果却不理想，培养约15 d后外植体开始出现叶片发黄、萎蔫和脱落等现象，这有可能是氮元素过多导致的。通过改良后，得到改良MS培养基，增殖培养阶段较适宜紫霞黄栌增殖生长，所以当使用1/2MS或是MS改良培养基将大量元素减半后，组培苗的长势明显比使用MS培养基有所提高，并且不易出现叶片、茎段发黄死亡的现象。紫霞黄栌作为彩叶树种，其叶片中叶绿素与花青素、胡萝卜素的比例较小，叶片中葉绿素含量和其他具体成分与生长机理尚未探明，有待进一步研究。

从试验结果可以看出，紫霞黄栌外植体在4.5～6.0的pH条件下都可以存活，但是在pH为4.5、4.8和6.0时存活情况较差，并且不能增殖；在pH为5.1～5.7可较好生长，pH 5.4左右应为最佳pH，增殖系数4.7。

在4种植物生长调节剂处理的增殖培养正交试验中，参照Peter等[18]的方法，选取6-BA、NAA、 IAA、2，4-D，分别采用0、1、10、100 μmol/L 4种浓度进行四因素四水平正交试验，培养15 d后增殖效果最好的是14号处理，评价得分4.23分，增殖系数8.97，组间偏差小，并且组培苗茎伸长明显，长势良好，底部有愈伤组织形成，发生不定芽，将愈伤组织切开后可继续培养并发生不定芽；8号和10号处理生长表现良好，并且茎部伸长明显，这可能是由于这两组处理中含有适量的6-BA并且有较多含量的IAA造成的。

6-BA在0～100 μmol/L范围内浓度越高，对组培苗生长影响越好，当使用大于100 μmol/L浓度时效果有待探讨；NAA与其他3种植物生长调节剂相互作用时，在1 μmol/L浓度时对组培苗生长效果明显，随着NAA浓度提高，组培苗长势减弱，并且基部容易产生较大的愈伤组织；IAA在10 μmol/L时最为适宜；2，4-D不添加时效果最好，随着2，4-D浓度增加组培苗生长效果变差。通过数据分析得到的最优组合为100 μmol/L 6-BA+1 μmol/L NAA+10 μmol/L IAA。

生根难度大一直以来是制约木本植物组培快繁的问题之一。生根培养阶段，在MS改良培养基的基础上添加0.2 mg/L NAA、0.3 mg/L IBA时生根率最高，但生根率仅有53%，尚不能满足大量培育生产的要求。因为受材料数量限制，生根试验仅用了0.1～0.3 mg/L IBA和0.1、0.2 mg/L NAA，在试验范围内生根率随着激素浓度升高而升高，后续试验可以继续提高2种植物生长调节剂的浓度观察组培苗生根率。

移栽阶段时，实际试验中发现紫霞黄栌组培苗个体间差异大，重复性不强。从同一植株取得材料表现相近，其中在诱导培养阶段长势良好的外植体在增殖培养阶段也会有相应地表现，并且在生根后移栽时易于成活。

3.2 结论

以紫霞黄栌为材料，通过采用组织培养技术培育外植体，最适宜的诱导分化培养基为MS基础培养基添加1.0 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA，一年生枝条和二年生枝条作为外植体的诱导率分别达到93.3%和73.3%。增殖培养最适宜条件为使用改良MS培养基作为基础培养基，pH调至5.4，同时添加100 μmol/L 6-BA、1 μmol/L NAA、10 μmol/L IAA，增殖系数最高达到8.97。生根培养阶段使用MS改良培养基，添加0.3 mg/L IBA和0.2 mg/L NAA时生根率达到53%。移栽阶段以消毒灭菌后的珍珠岩作为基质，温度控制为25 ℃，相对湿度保持在90%，移栽后组培苗成活率达到70%。使用该方法可整体大幅提高紫霞黄栌增殖的数量，为今后大规模培育该品种苗木资源提供理论依据。endprint

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