李欣宇+贾秀稳+杨林

摘要：为更有效地利用石榴（Punica granaum L.）花中多种活性成分，以石榴花为原料，利用乙醇溶剂浸提法，在单因素试验的基础上选择提取温度、提取时间、液固比、乙醇体积分数4个因素进行正交试验，优化了石榴花中3种活性物质同步提取工艺。结果表明，影响石榴花中多酚、黄酮及萜类物质同步提取的因素大小顺序为提取温度>提取时间>乙醇体积分数>液固比，其最优的工艺条件为60%乙醇溶液作为提取溶剂，液固比20∶1（mL∶g），85 ℃條件下提取2.0 h；在此条件下多酚、黄酮及三萜类物质的提取率分别是22.19%、6.53%、0.94%。石榴花中多酚、黄酮及萜类物质可以同步提取出来，可有效提高石榴花资源的利用率。

关键词：石榴（Punica granaum L.）花；多酚；黄酮；萜类；同步提取

中图分类号：R962 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）15-2926-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.15.032

Abstract： The aim is to provide a theoretical foundation for realizing the more efficient use of various ingredients from pomegranate flowers. Using the method of ethanol solvent extraction and pomegranate flowers as raw materials，the orthogonal experiment was carried out by choosing extraction temperature，extraction time，the ratio of liquid to solid and the volume fraction of ethanol on the basis of single factor experiment. The results showed that the sequence of influencing factors of polyphenols，flavonoids and terpenes extraction from pomegranate flowers were extraction temperature>extraction time>ethanol volume percentage>the ratio of liquid to solid. The best extraction conditions were 60% ethanol，the ratio of liquid to solid of 20∶1（mL∶g），the extraction temperature of 85 ℃，the extraction time of 2.0 h. Under the optimal conditions，the content of polyphenols，flavonoids and triterpenoids substances in extracts were respectively 22.19%，6.53% and 0.94%. It indicated that polyphenols，flavonoids and terpenes can be extracted synchronously from pomegranate flowers. It improved the availability of pomegranate flowers resources effectively.

Key words： pomegranate（Punica granaum L.） flowers；polyphenols；flavonoids；terpenes；synchronous extraction

石榴（Punica granaum L.）属于石榴科石榴属植物，落叶灌木或小乔木[1]。石榴花期长，开花量大，资源丰富[2]。石榴花中含有丰富的活性成分，其中以多酚类、类黄酮和三萜类物质为主[3，4]。这些活性成分具有抗氧化[5，6]、预防或抑制肿瘤[7，8]、抗菌[9]、抗动脉粥样硬化[10，11]、降血脂[12]、预防或治疗冠心病和中风等心脑血管疾病的生理功效[13-15]。因此，借助各种技术手段从石榴花中提取生物活性物质已成为目前的研究热点。

对于石榴花中的多酚、黄酮及萜类物质，目前多数仅提取和纯化其中一种成分，造成资源的浪费。如史晓华[16]用响应面超声酶法探究了石榴花中的总黄酮提取工艺，热依木古丽·阿布都拉等[17]用有机溶剂浸提法对新疆石榴花多酚的提取工艺进行研究，Fu等[18]采用超声波辅助提取法对石榴花中齐墩果酸和熊果酸等三萜类物质的最佳工艺进行了探索。目前，对石榴花中多酚、黄酮及萜类物质的同步提取研究鲜见报道。本研究在单因素试验的基础上，采用正交试验优化同步提取石榴花中多酚、黄酮及萜类物质工艺条件，旨在为充分利用石榴花中的生物活性成分，为石榴花资源的综合利用提供指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

石榴花样品，品种为岗榴，于2015年6月采自枣庄学院校园，由枣庄学院生命科学学院植物学教研室张立华教授鉴定为石榴科石榴属植物石榴的花，样品于65 ℃恒温烘干，放置于冰箱贮存备用。

没食子酸、熊果酸、芦丁标准品（纯度≥98%）：上海源叶生物科技有限公司；高氯酸、乙酸、无水乙醇、氢氧化钠、香草醛、亚硝酸钠、无水碳酸钠、硝酸铝等试剂均为分析纯，试验用水为去离子水。endprint

1.2 仪器与设备

UV-2600型紫外可见分光光度计[尤尼科（上海）仪器有限公司]；电子分析天平（上海越平科学仪器有限公司）；HH·SY21-Ni型电热恒温水浴锅（北京市长风仪器仪表公司）；LK-2000A型摇摆式高速中药粉碎机（新昌县城关红利数控制造厂）。

1.3 试验方法

1.3.1 单因素试验

1）提取温度对提取率的影响。精确称取5份0.50 g石榴花粉末分别置于150 mL锥形瓶中，在液固比30∶1（mL∶g，下同）、提取时间2.0 h、乙醇体积分数为70%的条件下，考察不同提取温度（55、65、75、85、95 ℃）对多酚、黄酮和萜类提取率的影响。

2）提取时间对提取率的影响。精确称取5份0.50 g石榴花粉末分别置于150 mL锥形瓶中，在液固比30∶1、提取温度75 ℃、乙醇体积分数为70%的条件下，考察不同提取时间（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）对多酚、黄酮和萜类提取率的影响。

3）液固比对提取率的影响。精确称5份0.50 g石榴花粉末分别置于150 mL锥形瓶中，按照液固比10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1加入体积分数为70%的乙醇，温度75 ℃条件下提取时间2.0 h，考察不同液固比对多酚、黄酮和萜类提取率的影响。

4）乙醇体积分数对提取率的影响。精密称取5份0.50 g石榴花粉末分别置于150 mL锥形瓶中，在提取时间2.0 h、提取温度75 ℃、液固比为30∶1的条件下，考察不同乙醇体积分数（50%、60%、70%、80%，90%）对多酚、黄酮和萜类提取率的影响。

1.3.2 正交试验设计 根据单因素试验结果，以提取温度、提取时间、液固比及乙醇体积分数4个因素为考察因素，以综合指标作为评价依据，进一步优化工艺参数。

1.3.3 黄酮含量的测定 黄酮含量的测定采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH比色法，参照文献[19]的方法并略作改进，具体操作步骤：取适量经稀释后的提取液于试管中，再加入0.3 mL 5%的亚硝酸钠溶液，摇匀，再加入10%的硝酸铝溶液0.3 mL，摇匀后放置5 min，加入1 mol/L的NaOH溶液4 mL，再加入0.7 mL 65%的乙醇溶液补充至6 mL，摇匀后放置5 min，于510 nm处测定其吸光度。以芦丁为标准品，并按公式计算相应的提取率。

式中，M为多酚、黄酮或萜类物质的质量（g），m为原料的质量（g）。

1.3.4 多酚含量的测定 多酚含量的测定采用福林-酚比色法，参照国家药典[20]中的方法并略作改进，具体操作步骤：加入1 mL Folin试剂于试管中，再加入适量经稀释后的提取液，用去离子水补齐至4 mL，之后加入6 mL 10%的NaCO3溶液，反应体系的总体积为10 mL，反应30 min后在750 nm处测定其吸光度。以没食子酸为标准品，按照公式计算总多酚的提取率。

1.3.5 萜类物质含量的测定 萜类物质的含量测定参照文献[21]中的方法并略作改进，具体操作步骤：取适量提取液于试管中，经挥干溶剂后加入5%香草醛乙酸溶液0.2 mL，高氯酸0.8 mL，将容量瓶放入60 ℃水浴中加热15 min，放冷至室温，再加冰醋酸4 mL，摇匀。置于548 nm处测定其吸光度。以熊果酸为标准品，并按照公式计算萜类物质的提取率。

1.3.6 统计分析 试验均设3个重复，试验数据以平均值±标准差（mean±SD）表示。采用Microsoft Office Excel和Origin Pro 8.0数据分析工具进行处理。

2 结果与分析

2.1 同步提取单因素试验结果

2.1.1 提取温度的影响 由图1可以看出，随着提取温度的逐渐增大，3种活性物质的提取率均呈先增加后下降的趋势。在提取温度为75 ℃时，黄酮和多酚的提取率最高，85 ℃时，萜类的提取率最高，再升高温度，这3种物质的提取率反而有所下降。原因可能是在适宜的温度范围内，这3种活性物质的热运动加剧，溶剂分子更易于进出细胞，同时多酚、黄酮和三萜类物质的溶出量也增加。但过高的温度会增加提取物的黏性，阻礙3种活性物质的溶出，从而使其提取率下降。

2.1.2 提取时间的影响 由图2可知，随着提取时间的逐渐增加，3种活性物质的提取率均呈先增加又下降或趋于平缓的趋势。当提取时间为2.0 h时，三萜类物质的提取率最高，随后呈略下降的趋势；提取2.5 h时，多酚和黄酮类物质的提取率达到最大，但进一步延长时间，提取率有所下降，可能是由于加热过程中黄酮、多酚等具有活泼酚羟基的物质发生氧化、聚合等反应，使提取率下降[22]，三萜类化合物的结构在长时间受热的情况下也可能发生变化，导致其提取率下降[23]。因此，综合考虑生产效益，正交试验中提取时间设置为1.5～2.5 h对3种物质的提取均较适宜。

2.1.3 液固比的影响 由图3可知，黄酮和三萜类化合物在液固比为20∶1时提取率达到最高，在液固比超过20∶1之后，三萜类物质则表现出明显的下降趋势，黄酮类物质则趋于稳定，在液固比为40∶1时提取率才明显下降，多酚提取率在30∶1之前明显上升，液固比为40∶1之后明显下降。综合上述，由3种活性物质提取率的变化趋势分析得到，提取剂使用量越大，溶液的渗透压也会越大，对3种化合物的渗出均有利，而且较大的溶剂量能够增加它们与溶剂的接触面积。但当液固比达到一定数值后，溶液体系中的渗透压已经趋于平衡，石榴花中大部分的活性物质已经渗出。因此，考虑到继续增加溶剂用量并不能提高3种物质的提取率，而且液固比越大，会增加其他物质的溶出还会导致提取率下降，同时也会增加后期浓缩时的能量消耗[24]。因此，正交试验中液固比设置为20∶1～40∶1。endprint

2.1.4 乙醇体积分数的影响 由图4可知，在一定范围内，随着乙醇体积分数的逐渐增大，3种活性物质的提取率均不同程度增加。乙醇体积分数为60%时，黄酮和多酚的提取率最高；乙醇体积分数为70%时，三萜类物质的提取率达到最高。根据相似相溶原理[25]，3种活性物质的溶出度与溶剂和这3种物质的极性有关。多酚和黄酮的极性相对较强，体积分数为60%的乙醇有利于二者提取；三萜物质极性较差，70%的乙醇有利其提取。因此，正交试验中乙醇的体积分数设置为50%～70%。

2.2 正交试验

根据单因素试验结果，选择提取温度（A）、提取时间（B）、液固比（C）和乙醇体积分数（D）4个条件作为影响3种活性物质提取的考查因素，采用 L9（34）正交试验进一步优化提取工艺，每组试验3个平行样，取平均值进行计算，并对结果进行极差分析，影响因素和水平见表1，正交试验结果见表2，因素水平直观分析见图5。

从表2、图5可以看出，4个因素对3种活性物质提取的影响显著。极差分析表明，对于多酚和黄酮，影响最大的因素是提取温度，影响最小的是乙醇体积分数，但对于萜类物质来说，影响最大的因素是液固比，影响最小的是提取温度。考虑到萜类物质所占比例较小，兼顾3种物质的总提取效率，综合评定影响3种物质同步提取的因素排列顺序为提取温度>提取时间>乙醇体积分数>液固比。黄酮的最佳提取工艺条件为A3B2C1D2，即最佳提取工艺条件为60%乙醇作为提取溶剂，在液固比20∶1、85 ℃条件下提取2.0 h。多酚和萜类物质的最佳提取工艺条件表现一致，均为A3B2C3D3，即最佳提取工艺条件为以70%乙醇为提取溶剂，在液固比40∶1、85 ℃条件下提取2.0 h。

2.3 验证试验结果

为确定最优的工艺条件，对A3B2C3D3和A3B2C1D2两种组合进行了验证性试验，具体工艺条件及结果见表3。结果表明，在A3B2C3D3组合工艺条件下，多酚、黄酮和萜类物质的提取率分别为21.62%、6.73%、1.13%，在A3B2C1D2组合条件下，多酚、黄酮及萜类物质的提取率分别为22.19%、6.53%、0.94%。在组合①试验条件下，黄酮和三萜类的含量稍高，在组合②试验条件下多酚的含量稍高，但3种活性物質的总提取率而言，组合②工艺组合稍高于组合①。而且组合①的液固比40∶1远高于组合②的20∶1，过多的溶剂不利于后续浓缩[26]，还会造成溶剂的浪费及增加石榴花中其他杂质成分的溶出。因此，从节约及后续处理等方面综合考虑，选择液固比为20∶1的②为最优提取工艺，即在85 ℃下，按照20∶1的比例，用60%的乙醇浸提2.0 h。验证试验表明，该组合条件下，多酚、黄酮及三萜类物质的提取率高于正交试验中的其他组合，说明此方案稳定可行。

3 结论

在单因素试验的基础上选取提取温度、时间、液固比和乙醇体积分数4个因素进行正交试验考察，结果表明，影响石榴花中多酚、黄酮及三萜类物质同步提取的顺序为提取温度>提取时间>乙醇体积分数>液固比。经过验证试验确定最佳工艺组合为A3B2C1D2，即提取温度85 ℃，提取时间为2.0 h，液固比为20∶1，乙醇体积分数为60%。在此工艺条件下，多酚、黄酮及萜类物质的提取率分别是22.19%、6.53%和0.94%。表明石榴花中这3种活性物质可以被同步提取出来，对于综合利用石榴花中的活性物质具有指导意义。

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