闫娈 杨德琴

重庆医科大学附属口腔医院牙体牙髓病科，口腔疾病与生物医学重庆市重点实验室，重庆市高校市级口腔生物医学工程重点实验室，重庆 401147

尼古丁通过调控Toll样受体4抑制牙周膜干细胞的成骨分化能力

闫娈 杨德琴

重庆医科大学附属口腔医院牙体牙髓病科，口腔疾病与生物医学重庆市重点实验室，重庆市高校市级口腔生物医学工程重点实验室，重庆 401147

目的探讨尼古丁对牙周膜干细胞（PDLSCs）增殖和成骨分化能力的调控作用，检测尼古丁能否通过调控Toll样受体4（TLR4）抑制PDLSCs的增殖及成骨分化能力。方法培养PDLSCs，采用流式细胞仪检测PDLSCs表面抗原标志，WST-1试剂盒检测不同浓度尼古丁刺激后PDLSCs增殖能力的改变。采用茜素红染色观察PDLSCs经不同浓度尼古丁刺激和成骨诱导后的矿化结节生产情况。运用实时定量聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot检测经尼古丁刺激后，PDLSCs成骨能力相关基因和蛋白的改变，以及尼古丁联合TLR4抑制剂TAK-242刺激后，PDLSCs成骨能力相关基因及蛋白的改变。。结果培养的细胞表达间充质干细胞表面标志物CD90和CD105，证实为PDLSCs。与对照组相比，培养3 d后，尼古丁浓度为10-4mol·L-1的PDLSCs的增殖能力受到明显抑制（P＜0.05）；成骨诱导21 d后，10-4mol·L-1尼古丁刺激组茜素红染色矿化结节明显减少。RT-PCR反应及Western blot显示：与对照组相比，尼古丁刺激组PDLSCs的碱性磷酸酶、骨钙素、Runt相关转录因子2的基因及蛋白表达量均降低（P＜0.05），加入TLR4抑制剂TAK-242后，尼古丁的抑制效应减弱。结论 尼古丁可能通过TLR4信号通路抑制PDLSCs的增殖及成骨分化能力。

尼古丁； 牙周膜干细胞； Toll样受体4； 成骨分化

慢性牙周炎是最常见的口腔疾病之一，可引起中老年人牙齿缺失，严重影响口腔健康。吸烟是导致慢性牙周炎的关键因素，烟叶中所含的尼古丁是损害牙周组织的重要危险因子[1]。研究[2-3]发现，在牙周治疗期间，不吸烟的牙周炎患者的疗效明显好于吸烟者，吸烟会加重牙周炎患者牙周组织的附着丧失及牙槽骨的吸收和破坏。牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）具有干细胞所特有的自我更新和多向分化能力，经成骨诱导后能向成骨方向分化。临床上可运用该特性进行牙周组织缺损的修复[4]。PDLSCs可表达Toll样受体4（Tolllike receptors 4，TLR4），其表达受到尼古丁的调控，尼古丁可以使炎症因子分泌增加，加重牙周组织丧失[5]。研究[6]发现，在慢性牙周炎的发生及发展过程中，TLR4参与了牙周组织的破坏，并且在这个过程中始终都有牙周组织的再生与修复。目前对尼古丁影响牙周组织再生修复机制的研究还较为少见。本研究目的在于研究尼古丁对PDLSCs成骨能力的影响及其作用机制，为临床治疗慢性牙周炎提供新的方法。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

α-MEM培养基（Gibco公司，美国），胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（杭州四季青生物工程有限公司），抗 CD105、抗Stro-1抗体（eBioscience公司，美国），抗CD90、抗CD31抗体（Biolegend公司，美国），Ⅰ型胶原酶（Gibco公司，美国），尼古丁硫酸盐（Sigma公司，美国），胰蛋白酶（Gibco公司，美国），TLR4抑制剂TAK-242（Apexbio公司，美国），RNA提取试剂盒、WST-1试剂盒（Takara公司，日本），实时定量聚合酶链反应（real timepolymerase chain reaction，RT-PCR）试剂盒（Life technologies公司，美国），抗碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）一抗（Abcam公司，英国），兔抗人Runt相关转录因子2（Runt-related transcription factor 2，Runx2）一抗（Santa Cruz公司，美国），鼠抗人骨钙素（osteocalcin，OCN）一抗（Abcam公司，英国），鼠抗人β-actin一抗、山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗（北京康为世纪生物科技有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 PDLSCs培养 2016年于重庆医科大学附属口腔医院收集新鲜拔除的完整无龋前磨牙，经PBS冲洗后用刀片刮下根中份1/3的牙周膜组织，离心，收集组织加入胶原酶，吹打成悬液，滴入6孔板，每孔加入2 mL含10%FBS的α-MEM培养基，置于孵箱中于37 ℃条件下培养。

1.2.2 PDLSCs表型鉴定 将第3代 PDLSCs消化，PBS冲洗，重悬，依照试剂盒说明进行操作，在各管内分别加入规定浓度的抗CD31-FITC、抗CD90-PE、抗CD105-PE、抗Stro-1-FITC。轻轻吹打，在4 ℃冰箱中避光孵育1 h，PBS清洗后置于流式细胞仪上检测细胞表面抗原表达情况。

1.2.3 PDLSCs增殖能力的检测 取第3代 PDLSCs，按每孔1×105个细胞的密度接种于96孔板，分别采用浓度为10-4、10-5、10-6mol·L-1的尼古丁进行刺激，采用WST-1试剂盒检测各组PDLSCs的增殖能力[7]。

1.2.4 PDLSCs成骨诱导 取第3代PDLSCs，消化计数后按每孔1×105个细胞的密度接种于6孔板，待细胞长至孔底90%后，换成骨诱导液。将PDLSCs根据加入尼古丁浓度的不同分为10-4、10-5、10-6mol·L-1尼古丁刺激组和对照组。成骨诱导PDLSCs时每3 d换液1次，共诱导21 d。PBS清洗，多聚甲醛固定，加入茜素红染液，行茜素红染色[7]。

1.2.5 相关成骨基因的检测 取第3代 PDLSCs，按每孔1×105个细胞的密度接种于12孔板，分为10-4mol·L-1尼古丁刺激组和对照组。待其长至孔底90%后，换为成骨诱导液，诱导7 d后按试剂盒说明书提取RNA进行RT-PCR，检测PDLSCs中ALP、OCN和Runx2基因的表达水平

1.2.6 相关成骨蛋白的检测 将第3代 PDLSCs按每孔1×105个细胞的密度接种于6孔板中，分为10-4mol·L-1尼古丁刺激组和对照组。待其长至孔底90%后，换为成骨诱导液，诱导至第14天，裂解细胞，提取总蛋白进行Western blot检测。检测步骤：十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）电泳，转膜，封闭2 h，洗膜，封闭一抗，4 ℃冷藏过夜；第2天TBST液洗膜3次，每次5 min，封闭二抗2 h，洗膜，显影。

1.2.7 加入拮抗剂TAK-242后PDLSCs相关成骨基因及蛋白的检测 根据是否加入尼古丁和抑制剂TAK-242，分为4组：对照组，10-4mol·L-1尼古丁组，尼古丁联合TAK-242 组，TAK-242组。实验方法同1.2.5 及1.2.6。

1.2.8 统计学分析 采用 SPSS 13.0软件进行统计分析，两组间数据比较采用t检验，多组间数据比较采用方差分析，检验水准为双侧α=0.05。

2 结果

2.1 PDLSCs鉴定

倒置显微镜下观察可见PDLSCs呈梭形或长梭形，体积较小，贴壁生长（图1）。采用流式细胞仪检测PDLSCs表面抗原标志，结果可见：2.6%的CD31表达阳性，96.3%的CD90表达阳性，95.6%的CD105表达阳性，6.6%的Stro-1表达阳性，说明培养的细胞表达间充质干细胞表面标志物，证实为PDLSCs。

图 1 PDLSCs形态 倒置显微镜Fig 1 PDLSCs morphology inverted microscope

2.2 不同浓度尼古丁刺激PDLSCs的增殖能力

在不同浓度的尼古丁刺激后，PDLSCs的增殖情况见表1。自培养第3天开始，与对照组相比较，10-6mol·L-1浓度组PDLSCs的增殖能力未发现明显改变，而10-4mol·L-1浓度组的PDLSCs的增殖能力受到了明显抑制（P＜0.05）。

表 1 4组PDLSCs增殖能力检测的光密度值Tab 1 The optical density of proliferation in four groups of PDLSCs±s

表 1 4组PDLSCs增殖能力检测的光密度值Tab 1 The optical density of proliferation in four groups of PDLSCs±s

注：与对照组相比，*P＜0.05。

组别1 d2 d3 d4 d5 d 10-4mol·L-10.37±0.270.37±0.710.37±0.02*0.20±0.02*0.17±0.01* 10-5mol·L-10.35±0.010.43±0.031.01±0.071.25±0.061.50±0.05* 10-6mol·L-10.34±0.010.57±0.021.38±0.031.78±0.032.13±0.12对照组0.34±0.010.48±0.011.29±0.021.97±0.032.25±0.06

2.3 尼古丁刺激PDLSCs后矿化物沉积

PDLSCs经不同浓度的尼古丁刺激，成骨诱导21 d后行茜素红染色，结果见图2。与空白对照组相比，不同浓度的尼古丁对PDLSCs的成骨分化均有一定影响，当尼古丁浓度为10-4mol·L-1时，PDLSCs成骨分化晚期矿化结节的形成最少，抑制作用最明显。

2.4 尼古丁刺激PDLSCs后相关成骨基因和蛋白的检测结果

PDLSCs在成骨诱导的过程中经浓度为10-4mol·L-1的尼古丁刺激，其成骨相关基因的表达情况见图3，蛋白的表达情况见图4。与对照组相比，ALP、OCN 和Runx2基因表达水平降低，差异具有统计学意义（P＜0.05），3种相关成骨蛋白的表达情况同样减弱，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图 3 尼古丁刺激PDLSCs后相关成骨基因的检测结果Fig 3 Detection results of osteogenic genes of PDLSCs stimulated by nicotine

图 4 尼古丁刺激PDLSCs后相关成骨蛋白的检测结果Fig 4 Detection results of osteogenic protein of PDLSCs stimulated by nicotine

2.5 TAK-242部分逆转尼古丁对PDLSCs成骨相关基因表达的抑制作用

加入拮抗剂TAK-242后PDLSCs相关成骨蛋白及基因的检测结果见图5、6。对PDLSCs成骨诱导7 d，检测相关成骨基因和蛋白的表达情况，结果显示，与对照组相比，成骨相关基因及蛋白水平在10-4mol·L-1的尼古丁作用下的表达量均有所下降，与对照组的差异有统计学意义（P＜0.05）；加入TAK-242后，成骨相关基因及蛋白表达水平上升，与对照组的差异无统计学意义（P＞0.05），与尼古丁组的差异均有统计学意义（P＜0.05），可见TAK-242部分抑制了尼古丁对PDLSCs的负向效应。

图 5 加入拮抗剂TAK-242后PDLSCs成骨相关蛋白检测结果Fig 5 Detection results of osteogenic protein of PDLSCs after given TAK-242

图 6 加入拮抗剂TAK-242后PDLSCs成骨相关基因检测结果Fig 6 Detection results of osteogenic genes of PDLSCs after given TAK-242

3 讨论

吸烟对慢性牙周炎的发生发展起着重要作用。Duane[8]指出，吸烟者的牙槽骨吸收严重程度明显大于不吸烟者。成年吸烟者龈沟液尼古丁浓度为10-7～10-3mol·L-1[9]，本实验采用相似的浓度进行研究。

PDLSCs具有干细胞所特有的增殖和多向分化的能力，在牙周组织再生与修复的过程中有至关重要的作用。本实验用不同浓度的尼古丁刺激PDLSCs，检测PDLSCs的增殖能力，结果显示：经过不同浓度的尼古丁刺激后，PDLSCs的增殖能力均在一定程度上受到了抑制，提示吸烟患者的牙槽骨再生及牙周修复能力较弱的原因之一可能就是尼古丁在一定程度上抑制了PDLSCs的增殖。PDLSCs经过成骨诱导后能够表达成骨相关基因和蛋白，表明PDLSCs能向成骨细胞分化，具有形成牙周骨组织的潜力。本实验在基因水平和蛋白水平证实，一定浓度的尼古丁能抑制PDLSCs的成骨能力。基因水平检测结果表明，经过一定浓度尼古丁刺激后，相关成骨基因，包括ALP、Runx2和OCN，在PDLSCs中的表达水平均存在着一定程度的下降。相关成骨蛋白（ALP、Runx2和OCN蛋白）的表达水平同样有所降低。有学者[10]认为，尼古丁改变了吸烟者龈沟液的局部微环境，影响了细胞的增殖能力，致使吸烟者牙周骨质再生修复能力较弱。PDLSCs表达TLR4，尼古丁通过调控TLR4作用于PDLSCs，引起下游信号通路的变化[10]。Tilp等[11]发现，经过尼古丁刺激牙周组织后，牙周组织中TLR4表达增加，说明TLR4可能是尼古丁破坏牙周组织的重要途径。TLR4在牙周组织炎症反应中发挥了重要作用，一方面，TLR4特异性激动剂尼古丁促进乙酰胆碱的释放，导致牙周组织的炎症因子增加[12]；另一方面，尼古丁可以直接同免疫炎症细胞表达的TLR4结合，影响肿瘤坏死因子-α等促炎因子的释放，加剧牙周组织的破坏[13]。本实验发现，受体TLR4同特异性激动剂尼古丁结合的过程受到调控之后，经过尼古丁和/或其竞争性拮抗剂TAK-242刺激，PDLSCs所表达的成骨相关基因及蛋白存一定程度的降低，提示尼古丁可能通过调控TLR4抑制牙周膜干细胞的成骨分化能力。

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（本文编辑 吴爱华）

The effect of Toll-like receptor 4 in nicotine suppressing the osteogenic potential of periodontal ligament stem cells

Yan Luan, Yang Deqin.
(Dept. of Conservative Dentistry and Endodontics, Stomatological Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing Key Laboratory of Oral Diseases and Biomedical Sciences, Chongqing Municipal Key Laboratory of Oral Biomedical Engineering of Higher Education, Chongqing 401147, China)

ObjectiveTo explore the impact of nicotine on proliferation and osteogenic capability of periodontal ligament stem cells (PDLSCs), and the role of Toll-like receptor 4 (TLR4) in nicotine, suppressing the osteogenic capability of PDLSCs.MethodsPDLSCs were cultured in vitro, and the fow cytometer was used to identify the surface antigen markers of PDLSCs. WST-1 was used to detect the proliferation ability of PDLSCs, which were stimulated by different concentrations of nicotine. Alizarin red staining was used to observe the formation of mineralized nodules after PDLSCs stimulation with different concentrations of nicotine. Real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western blot were used to detect the change in osteogenic potential of PDLSCs stimulated by nicotine, after TAK-242, and with the inhibitor of TLR4.ResultsPDLSCs expressed mesenchymal stem cell-associated markers CD90 and CD105. When the concentration of nicotine was 10-4mol·L-1, the PDLSC proliferation could be suppressed after 3 d compared with the control group (P＜0.05). Theamount of mineralized nodules reduced after osteogenic differentiation at 21 d by alizarin red staining. RT-PCR and Western blot showed the expression levels of alkaline phosphatase (ALP), and osteocalcin (OCN), and the Runt-related transcription factor-2 (Runx-2) were lower than in the control group when nicotine suppressed the PDLSCs (P＜0.05). This effect was attenuated after TAK-242 was added.ConclusionNicotine suppresses the proliferation and osteogenic capability of PDLSCs, which may be regulated by TLR4.

nicotine; periodontal ligament stem cells; Toll-like receptors 4; osteogenic differentiation

R 781.4

A

10.7518/hxkq.2017.04.005

Supported by: National Natural Science Foundation of China (31571508, 31371473); The Seventh Batch of Key Discipline Construction Project of Chongqing—Endodontics and Operative Dentistry (2011); Key Project of Medical Research Program of Chongqing Municipal Health Bureau (2011-1-062); Science and Technology Project of Yubei District in Chongqing [Yubei Finance and Education (2011) No. 33]. Correspondence: Yang Deqin, E-mail: yangdeqin@gmail.com.

2017-01-06；

2017-04-02

国家自然科学基金面上项目（31571508，31371473）；重庆市第七批重点学科建设项目（牙体牙髓病学，2011年）；重庆市卫生局医学科研计划重点项目（2011-1-062）；重庆市渝北区科技项目[渝北财教(2011)33号]

闫娈，住院医师，硕士，E-mail：24425122@qq.com

杨德琴，教授，博士，E-mail：yangdeqin@gmail.com