王莹王奇民李敬华韩金宏,4王莉莉巢晨周建华童磊鲁旭飞,6周元廖奕翔何宗轩李宁曹蕾刘文君陈正岗,9

1.潍坊医学院口腔医学院，潍坊 261021；

2.青岛市市立医院口腔颌面外科；

3.中心实验室，青岛 266071；

4.烟台市口腔医院口腔颌面外科，烟台 264008；

5.南京医科大学青岛临床学院普外科，青岛 266071；

6.即墨市普东卫生院口腔科，青岛 266234；

7.大连医科大学研究生院，大连 116044；8.青岛市市立医院耳鼻喉科，青岛 266071；

9.上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔颌面外科，上海 200011

体外沉默异戊二烯化酶二牛龙牛儿基转移酶Ⅰ对舌鳞状细胞癌增殖的影响

王莹1王奇民2李敬华3韩金宏2,4王莉莉3巢晨5周建华2童磊2鲁旭飞2,6周元1廖奕翔2何宗轩2李宁7曹蕾7刘文君8陈正岗2,9

1.潍坊医学院口腔医学院，潍坊 261021；

2.青岛市市立医院口腔颌面外科；

3.中心实验室，青岛 266071；

4.烟台市口腔医院口腔颌面外科，烟台 264008；

5.南京医科大学青岛临床学院普外科，青岛 266071；

6.即墨市普东卫生院口腔科，青岛 266234；

7.大连医科大学研究生院，大连 116044；8.青岛市市立医院耳鼻喉科，青岛 266071；

9.上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔颌面外科，上海 200011

目的研究异戊二烯化酶二牛龙牛儿基转移酶Ⅰ（GGTase-Ⅰ）在舌鳞状细胞癌增殖中的作用。方法登录Genebank确定人GGTase-Ⅰ基因序列，设计3条小干扰RNA（siRNA），并将siRNA转染至舌癌细胞Cal-27（GGTase-ⅠsiRNA组）。设立空白对照组（只加入转染试剂，不加入siRNA）和阴性对照组（NC-siRNA）。采用实时定量聚合酶链反应和蛋白质免疫检测转染后各组细胞GGTase-Ⅰ、RhoA的mRNA和蛋白表达；蛋白质免疫检测转染48 h后Cyclin D1、p21的表达变化；细胞增殖活性检测试剂盒和流式细胞术检测细胞的增殖活性和细胞周期变化。。结果与阴性对照组和空白对照组相比，GGTase-Ⅰ siRNA 组细胞的GGTase-Ⅰ的mRNA和蛋白表达下降（P＜0.05），RhoA 的mRNA和蛋白表达无明显改变（P＞0.05）；Cyclin D1的表达下降，p21表达升高，细胞的增殖活性下降，细胞周期发生改变（P＜0.05）。结论 GGTase-Ⅰ siRNA能抑制舌鳞状细胞癌细胞中GGTase-Ⅰ的表达，抑制细胞增殖，提示GGTase-Ⅰ在舌鳞状细胞癌增殖中可能发挥重要作用。

异戊二烯化酶二牛龙牛儿基转移酶Ⅰ； RhoA； 舌鳞状细胞癌； 增殖； Cyclin D1； p21

Rho家族蛋白是小G蛋白Ras超家族成员，具有GTP酶活性，是已知的与肿瘤密切相关的蛋白[1]。研究[2]证实，Rho家族蛋白在多种肿瘤中高表达，参与调节细胞肌动蛋白骨架、细胞极性、基因表达和细胞周期等，与肿瘤细胞的增殖密切相关。Rho家族蛋白需要通过异戊二烯化酶二牛龙牛儿基转移酶Ⅰ（geranylgeranyltransferaseⅠ，GGTase-Ⅰ）对其羟基端氨基酸序列进行翻译后修饰，使蛋白正确地定位于胞膜上才能正常发挥功能[3]。因此，GGTase-Ⅰ在Rho蛋白发挥生物活性的过程中起到关键作用。近年来关于Rho家族特别是RhoA蛋白及其下游蛋白对癌症的作用的研究较多，但对于GGTase-Ⅰ在癌症特别是舌癌中的作用研究较少。

本研究应用RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术，通过体外设计合成人舌鳞状细胞癌细胞株Cal-27 GGTase-Ⅰ基因的siRNA并转染进入细胞，观察小干扰RNA（small interfering RNAs，siRNA）对GGTase-Ⅰ的抑制作用，探讨其对舌癌细胞增殖的影响，为GGTase-Ⅰ在舌癌治疗中的应用提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 主要材料和试剂

人舌鳞状细胞癌细胞株Cal-27购自中南大学高等研究中心。

胎牛血清（Gibco公司，美国），1640培养基、胰蛋白酶（Hyclone公司，美国），DMSO（Amresco公司，美国），RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、SuperRealPreMix Plus （SYBR Green ） FP 205（北京天根生化科技有限公司），实时定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）引物GGTase-Ⅰ、RhoA设计合成（TAKARA公司，日本），实时定量PCR内参磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH）（上海生工生物工程股份有限公司），siRNA片段设计合成、转染试剂（广州市锐博生物科技有限公司），鼠抗人GGTase-Ⅰ、RhoA（Santa公司，美国），兔抗人GAPDH、Cyclin D1、p21、羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG二抗（武汉伊莱瑞特生物科技有限公司），细胞增殖活性检测试剂盒（cell counting kit-8，CCK-8）（上海七海复泰生物科技有限公司），细胞周期与凋亡检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），RIPA裂解液（北京索莱宝科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 细胞培养选用含10%胎牛血清、青霉素100 mg·mL-1和链霉素100 mg·mL-1的1640培养基，置于37 ℃、5%CO2恒温孵育箱中培养。待细胞铺满瓶底后，弃原培养液，PBS冲洗2次，加入1.0 mL 0.25%胰蛋白酶放于孵育箱内约5 min，显微镜下观察，发现细胞胞质回缩、间隙增大，加入等体积的含血清的培养基终止消化，将所有液体移入15 mL离心管内，1 000 r·min-1离心5 min，弃上清，离心管内加入12 mL培养基，反复吹打直至单细胞悬液。计数，按1∶2比例传代接种在新的培养瓶中。

1.2.2 GGTase-ⅠsiRNA的合成 登录Genebank确定人GGTase-Ⅰ的基因序列，序列号为NM_005023.3，针对基因序列设计3条siRNA（表1）。

1.2.3 siRNA转染沉默GGTase-Ⅰ基因 转染前1 d按每孔5×105个将处于对数生长期的Cal-27细胞接种于6孔板中，每孔加入2 mL不含抗生素的培养基。转染时细胞密度为30%～50%。120 μL 1×riboFECT™CP Buffer稀释5 μL 20 μmol·L-1siRNA储存液，轻轻混匀。加入12 μL riboFECT™ CP试剂，轻轻吹打混匀，室温孵育0～15 min。弃原培养基，PBS冲洗3遍，每孔加入1 863 μL含血清培养基，将riboFECT™CP混合液加入到细胞培养基中，使siRNA终浓度为50 nmol·L-1，轻轻混匀。将培养板置于37 ℃的CO2孵育箱中培养。实验组为转染GGTase-Ⅰ siRNA组（又分为GGTase-Ⅰ siRNA 1组、GGTase-Ⅰ siRNA 2组、GGTase-Ⅰ siRNA 3组），对照组为空白对照组（只加入转染试剂，不加入siRNA）和阴性对照组（NC-siRNA）。

表 1 针对GGTase-Ⅰ基因序列设计的3条GGTase-Ⅰ siRNATab 1 Three GGTase-Ⅰ siRNA sequences designed for GGTase-Ⅰ gene

1.2.4 实时荧光定量PCR检测各组GGTase-Ⅰ、RhoA 的mRNA表达 对转染48 h的细胞进行总RNA提取，紫外分光光度计测定RNA含量和浓度，取5 μL的总RNA，将RNA反转录为cDNA，取1 μL反转录产物进行PCR扩增反应，以GAPDH为内参照。GGTase-Ⅰ的上游引物序列：5’-CTCCTGCTGATTTCACTTTGG-3’，下游引物序列：5’-CCACGACAAAGTTGTGGTTCA-3’，产物大小为102 bp；RhoA的上游引物序列：5’-GCTGGACTCGGATTCGTTG-3’，下游引物序列：5’-TGGGAACTGGTCCTTGCTG-3’，产物大小为120 bp。反应条件：95 ℃预变性15 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火/延伸31 s，共40个循环。荧光信号实时检测和数据分析由Stratagene荧光定量PCR仪自动完成，结果采用相对定量法，采用2-∆∆Ct公式计算GGTase-Ⅰ、RhoA mRNA的相对表达水平，其中Ct值为循环阈值。实验重复3次。

1.2.5 蛋白质免疫印迹法（Western blotting）检测各组细胞的蛋白表达 提取各组细胞的蛋白质，等量上样，采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）电泳分离，电转移（转膜条件：GAPDH、GGTase-Ⅰ，200 mA，90 min；Rho A，200 mA，70 min），5%脱脂奶粉室温摇床封闭2 h后，加入一抗（GAPDH，1︰1 000；GGTase-Ⅰ，1︰200；RhoA，1︰500），4 ℃孵育过夜，三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水（triethanolamine buffered saline，TBST）冲洗3次，加入二抗（1︰50 000），37 ℃摇床孵育2 h。TBST冲洗后，电化学发光（electrochemiluminescence，ECL）检测，显色曝光。实验重复3次。

根据GGTase-Ⅰ蛋白和mRNA表达量选取GGTase-Ⅰ siRNA组中沉默效率最强的一组作为实验组。检测实验组、阴性对照组、空白对照组细胞Cyclin D1、p21蛋白表达，方法同前（转膜条件：Cyclin D1，200 mA，90 min；p21，200 mA，70 min。一抗浓度：Cyclin D1，1︰500；p21，1︰500）。实验重复3次。

1.2.6 CCK-8试剂盒检测Cal-27增殖能力 将细胞每孔2 000个接种于96孔培养板中，待细胞融合约30%时，实验组、阴性对照组、空白对照组分别转染siRNA，使siRNA终浓度为50 nmol·L-1。实验每组设5个复孔。按照试剂盒说明书操作，分别测定转染0、24、48 h后450 nm波长下各孔吸光度值，比较组间差异。实验重复3次。

1.2.7 流式细胞仪检测Cal-27细胞周期 实验组、阴性对照组、空白对照组分别收集转染48 h后的6孔板细胞（每组至少6个孔），PBS冲洗3次，用0.25%胰酶消化细胞，用含血清的培养液中止，轻轻吹打，收集细胞悬液，1 000 r·min-1离心5 min，小心吸除上清。按照说明书放入流式细胞仪检测细胞周期。实验重复3次。

1.3 统计学处理

采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，计量资料的组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 转染后各组细胞的mRNA表达

实时荧光定量PCR检测结果表明，转染48 h后，与阴性对照组和空白对照组相比，GGTase-Ⅰ siRNA 组Cal-27细胞的GGTase-Ⅰ mRNA表达下降（P＜0.05）；GGTase-Ⅰ siRNA组间相比，GGTase-Ⅰ siRNA 2组的mRNA表达低于GGTase-Ⅰ siRNA 1组和GGTase-Ⅰ siRNA 3组（P＜0.05），表明GGTase-Ⅰ siRNA 2组的干扰效果优于GGTase-Ⅰ siRNA 1组和GGTase-Ⅰ siRNA 3组。各组的RhoA mRNA表达无统计学差异（P＞0.05）（图1）。

2.2 转染后各组细胞的GGTase-Ⅰ、RhoA蛋白表达

Western blotting检测结果表明，转染48 h后，与阴性对照组和空白对照组相比，GGTase-Ⅰ siRNA组Cal-27细胞的GGTase-Ⅰ蛋白表达下降（P＜0.05）；GGTase-Ⅰ siRNA组间相比，GGTase-Ⅰ siRNA 2组的GGTase-Ⅰ蛋白表达低于GGTase-Ⅰ siRNA 1组和GGTase-Ⅰ siRNA 3组（P＜0.05），表明GGTase-ⅠsiRNA 2组的干扰效果优于GGTase-Ⅰ siRNA 1组和GGTase-Ⅰ siRNA 3组。各组的RhoA 蛋白表达无统计学差异（P＞0.05）（图2）。

图 1 转染48 h后各组的GGTase-Ⅰ、RhoA mRNA表达Fig 1 Expression of GGTase-Ⅰ, RhoA mRNA 48 h after transfection of every group

图 2 转染48 h后各组的GGTase-Ⅰ、RhoA蛋白表达Fig 2 Expression of GGTase-Ⅰ, RhoA protein 48 h after transfection of every group

2.3 转染后各组细胞的Cyclin D1、p21蛋白表达

根据mRNA和Western blotting检测结果，选取干扰效率最强的GGTase-Ⅰ siRNA 2组作为实验组。Western blotting检测结果表明，转染48 h后实验组与阴性对照组和空白对照组相比，Cyclin D1蛋白表达下降，p21蛋白表达升高（P＜0.05）（图3）。

图 3 转染48 h后各组Cyclin D1、p21蛋白的表达Fig 3 Expression of Cyclin D1, p21 protein 48 h after transfection of every group

2.4 转染不同时间各组细胞的增殖变化

转染0、24、48 h后，空白对照组和阴性对照组之间的细胞增殖能力无明显差异，而实验组细胞的增殖能力下降（P＜0.05）（图4）。

图 4 转染不同时间各组细胞的增殖活力Fig 4 Cell proliferation ability with different time after transfection of every group

2.5 转染后各组细胞周期的变化

流式细胞仪检测结果（图5）表明，转染48 h后，与空白对照组和阴性对照组相比，实验组的S期细胞下降，G2期细胞上升（P＜0.05）。

图 5 转染48 h后各组的细胞周期变化Fig 5 The effect of cell cycle 48 h after transfection of every group

3 讨论

Rho家族蛋白具有GTP酶活性，是目前研究较多的与癌症相关的基因家族[4]。Rho家族蛋白成员参与了细胞骨架调节、细胞转录调控、细胞周期进程、细胞微管运输等多种与癌症相关的信号通路的调节[5]。Rho蛋白的羟基端氨基酸序列为CAAX基序，其中“C”为半胱氨酸，“A”为脂肪族氨基酸，“X”代表任意氨基酸。GGTase-Ⅰ由α、β两个亚基组成，对包括Rho家族蛋白在内的多种GTP酶的CAAX序列进行异戊二烯化，参与GTP酶蛋白的翻译后修饰，引导酶蛋白正确定位于细胞膜上，是GTP酶被激活的前提[6]。研究[7]证实，GGTase-Ⅰ对癌细胞的增殖、迁移、凋亡以及化疗敏感性都有不同程度的影响，抑制GGTase-Ⅰ的活性可抑制肿瘤细胞增殖，从而抑制肿瘤的发展。

本实验证实GGTase-Ⅰ基因沉默后，RhoA基因的mRNA和蛋白变化无明显变化，推测GGTase-Ⅰ基因与RhoA的细胞内合成无关；同时，抑制细胞GGTase-Ⅰ基因的表达后，发现细胞的增殖受到抑制，细胞周期发生改变，Cyclin D1表达明显下降，p21表达明显上升。

真核细胞的细胞周期分为4个阶段：G1期、S期、G2期、M期。G1/S期的过程决定细胞能否进行DNA复制，是细胞增殖的关键。肿瘤的发生、发展、侵袭及远处转移都与细胞增殖活性密切相关，细胞的增殖失控是恶性肿瘤的典型特点。细胞增殖主要由细胞周期调节因子细胞周期素（Cyclins）和细胞周期依赖性激酶（Cyclin-dependent kinases，CDKs）等蛋白控制，受多种信号机制调控。Cyclin D1是发现最早的原癌基因[8]，在肝癌[9]、食管癌[10]、肠癌[11]、宫颈癌[12]等多种肿瘤细胞中过度表达，是G1期细胞向S期转变的关键蛋白[13-14]。RhoA、Rac 和Cdc42都能促进Cyclin D1的转录，Rac还可参与促进Cyclin D1的mRNA翻译[15]。本研究结果显示，沉默GGTase-Ⅰ后，Cyclin D1的表达下降，细胞G1/S期转变受抑制，S期细胞明显下降，细胞增殖明显被抑制，与沉默RhoA后细胞增殖活性下降的研究结果一致[16]。

Rho家族蛋白除上调Cyclin D1外，还可以下调细胞周期蛋白依赖性激酶抑制物（Cyclin-dependent kinase inhibitor protein，CDKI）。有丝分裂抑制因子p21是第一个被发现的CDKIs成员，可被P53诱导生成，抑制DNA复制，阻止CDKs与特异Cyclin结合，包括Cyclin A/CDK2、Cyclin E/CDK2、Cyclin D1/CDK4和Cyclin D2/CDK4等的结合[17-19]，从而抑制细胞G1/S期的转变，负性调节细胞周期，抑制细胞增殖[20-21]。研究[22-23]证实，上调p21在细胞中的表达，可以抑制DNA复制，抑制肿瘤细胞G1/S期的转变，从而抑制细胞过度增殖，与肿瘤的治疗和预后正相关。使用RhoA抑制剂辛伐他汀可通过抑制RhoA表达，使细胞内p21显著上调，抑制细胞增殖[24]。此外还有研究[25]证实，GGTase-Ⅰ可能通过调节P53来发挥细胞周期的调控。本研究中，抑制GGTase-Ⅰ后，RhoA的基因和蛋白表达均无明显变化，而Cyclin D1明显下降，p21蛋白表达显著上升，推测GGTase-Ⅰ是在RhoA蛋白修饰过程中发挥了重要作用，未对RhoA基因表达产生抑制，并通过促进Cyclin D1生成、抑制p21表达来影响肿瘤细胞的增殖。

本实验证实，GGTase-Ⅰ siRNA可以有效地抑制人舌鳞状细胞癌细胞株Cal-27的GGTase-Ⅰ表达，改变细胞周期，抑制细胞增殖，推测抑制GGTase-Ⅰ表达可以抑制RhoA蛋白的翻译后修饰从而抑制RhoA蛋白活性，调控Cyclin D1和p21的表达，改变细胞周期，抑制舌癌细胞的增殖，证实了GGTase-Ⅰ可能作为舌鳞状细胞癌基因治疗的靶点，为肿瘤的治疗提供新的治疗思路，但其在Rho家族蛋白的具体作用机制尚需进一步研究。

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（本文编辑 李彩）

Effects of geranylgeranyltransferaseⅠsilencing on the proliferation of tongue squamous cancer cells

Wang Ying1, Wang Qimin2, Li Jinghua3, Han Jinhong2,4, Wang Lili3, Chao Chen5, Zhou Jianhua2, Tong Lei2, Lu Xufei2,6, Zhou Yuan1, Liao Yixiang2, He Zongxuan2, Li Ning7, Cao Lei7, Liu Wenjun8, Chen Zhenggang2,9.
(1. College of Stomatology, Weifang Medical University, Weifang 261021, China; 2. Dept. of Oral and Maxillofacial Surgery, Qingdao Municipal Hospital, Qingdao 266071, China; 3. Central Lab, Qingdao Municipal Hospital, Qingdao 266071, China; 4. Dept. of Oral and Maxillofacial Surgery, Yantai Stomatological Hospital, Yantai 264008, China; 5. Dept. of Surgery, Qingdao Clinical Hospital Affiliated to Nanjing Medical University, Qingdao 266071, China; 6. Dept. of Stomatology, Pudong Hospital of Jimo City, Qingdao 266234, China; 7. Postgraduate School, Dalian Medical University, Dalian 116044, China; 8. Dept. of Otorhinolaryngology, Qingdao Municipal Hospital, Qingdao 266071, China; 9. Dept. of Oral and Maxillofacial Surgery, Shanghai Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200011, China)

ObjectiveThis study aims to investigate the effect of geranylgeranyltransferaseⅠ (GGTase-Ⅰ) on the proliferation and growth of tongue squamous cancer cells.MethodsThree small interfering RNAs (siRNAs) were designed on the basis of the GGTase-Ⅰ sequence inGeneBank. These siRNAs were then transfected into tongue squamous cancer cells Cal-27. The mRNA and protein expression of GGTase-Ⅰ and RhoA were examined by real-time quantitative polymerase chain reaction and Western blotting, respectively. The expression of Cyclin D1 and p21 were examined by Western blotting. The proliferation and growth ability were analyzed by cell counting kit-8 assay and fow cytometry.ResultsThe mRNA and protein expression of GGTase-Ⅰ in Cal-27 was reduced signifcantly after the GGTase-Ⅰ siRNAs were transfected (P＜0.05). No signifcant difference in RhoA mRNA and protein expression was detected (P＞0.05). Cyclin D1 expression decreased, whereas p21 expression increased signifcantly. The cell cycle was altered, and the growth-proliferative activity was inhibited (P＜0.05).ConclusionGGTase-Ⅰ siRNA can inhibit the expression of GGTase-Ⅰ and the proliferative activity of tongue squamous cancer cells. GGTase-Ⅰ may be a potential target for gene therapy in tongue squamous cell cancer.

geranylgeranyltransferaseⅠ; RhoA; tongue squamous cancer; proliferation; Cyclin D1; p21

R 739.8

A

10.7518/hxkq.2017.04.006

Supported by: The National Natural Science Foundation of China (81372908); Project of Qingdao Municipal Health and Family Planning Commission (2014-WJZD009, 2013-WSZD011). Correspondence: Chen Zhenggang, E-mail: chenzhg1973 @163.com.

2016-10-11；

2017-04-09

国家自然科学基金（81372908）；青岛市卫计委计划项目（2014-WJZD009，2013-WSZD011）

王莹，硕士，E-mail：469055264@qq.com

陈正岗，副主任医师，博士，E-mail：chenzhg1973@163. com