李霞 余枭 余灿 李志强 韩铎 黄珲 尚明铭 朱红伟

·论著·

自噬相关基因在小鼠急性胰腺炎中的表达及其意义

李霞 余枭 余灿 李志强 韩铎 黄珲 尚明铭 朱红伟

目的 检测小鼠急性胰腺炎(AP)胰腺组织中自噬相关基因微管相关蛋白1轻链3(LC3)、p62和溶酶体相关膜蛋白2(LAMP-2)的表达，并探讨其意义。方法 20只小鼠随机分为AP组和对照组。采用腹腔内注射20%L-精氨酸溶液(4 g/kg体重)2次、间隔1 h的方法制备AP模型；对照组腹腔注射等容积生理盐水。24 h后观察两组小鼠胰腺组织的病理改变，采用蛋白质印迹法检测小鼠胰腺组织LC3、p62和LAMP-2蛋白的表达。结果 对照组小鼠胰腺组织未见明显病理改变； AP组小鼠胰腺腺泡水肿，腺泡结构破坏、消失，叶间隔、小叶间隔及腺泡间隔显著增宽，腺泡细胞呈不同程度变性坏死。AP组胰腺组织水肿、出血、坏死和炎症评分分别为(3.13±0.50)、(2.83±0.32)、(3.25±0.46)、(3.16±0.47)分，对照组的4项评分均为0分，差异均有统计学意义(P值均<0.01)。AP组胰腺组织LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及p62、LAMP-2蛋白表达量分别为1.16±0.08、0.94±0.04、0.35±0.04；对照组分别为0.24±0.02、0.34±0.03、0.95±0.03。AP组胰腺组织LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、p62蛋白表达显著高于对照组，LAMP-2蛋白表达显著低于对照组，差异均有统计学意义(P值均<0.01)。结论 腹腔注射L-精氨酸诱导AP后小鼠胰腺组织出现自噬受损，这可能与AP时胰腺组织LAMP-2蛋白表达下降有关。

胰腺炎； 自噬； 微管相关蛋白质类； p62； 溶酶体相关膜蛋白2

Fund program:National Natural Science Foundation of China(81570585)；Natural Science Foundation of Hunan Province (2015JJ6114)；Foundation of Science and Technology Department of Hunan Province (2014FJ6043)

自噬(autophagy)是细胞利用溶酶体降解自身受损的细胞器和大分子物质从而实现细胞稳态和细胞器的更新，是真核细胞特有的生命现象[1]。自噬在细胞清除废物、重建结构以及生长发育、维持内环境稳定中起重要作用，并与疾病的发生密切相关[2-3]。微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3, MAP1-LC3，LC3)是目前观察自噬现象是否存在、研究自噬活性最常用的生物学标志物[4-5]。 p62(又名SQSTM1)是一种泛素结合蛋白，可与 LC3-Ⅱ形成复合物，并将蛋白质转运到自噬溶酶体内降解，负向调控自噬的活性，也是检测自噬活性的一个标志蛋白[6-7]。此外，溶酶体相关膜蛋白2(lysosome-associated membrane protein 2, LAMP-2)可用于监测自噬体与溶酶体的融合，是检测自噬活性较为可靠的标志蛋白[8]。本研究检测急性胰腺炎(AP)小鼠胰腺组织LC3、p62和LAMP-2蛋白表达的变化，以揭示AP发生和发展的机制。

材料和方法

一、实验动物及分组

20只健康雄性昆明小鼠，体重(25±5)g，由中南大学湘雅三医院动物实验中心提供。按数字表法随机分为对照组和AP组，每组10只。实验前小鼠禁食24 h，自由饮水。采用腹腔内注射20%L-精氨酸4 g/kg体重(Sigma公司)2次、间隔1 h的方法制备AP模型。对照组腹腔注射等容积生理盐水。第2次腹腔注射后24 h处死小鼠，取胰腺组织，部分置4%多聚甲醛溶液中固定，部分放入冻存管后迅速投入液氮罐冷冻，再置-80℃冰箱保存。

二、胰腺组织病理学检查

取甲醛固定的胰腺组织标本，石蜡包埋，4 μm连续切片，常规HE染色，由病理专科医师采用双盲法在光镜下读片，每张切片随机选择5个高倍视野，观察胰腺组织病理变化，并参照Schmidt等[9]的标准进行病理评分。

三、胰腺组织LC3、p62和LAMP-2蛋白表达检测

将冷冻的胰腺组织置于洁净匀浆器中，每20 mg组织加入200 μl蛋白裂解液充分裂解，收集组织总蛋白，BCA 法测定蛋白质含量。取50 μg蛋白常规行蛋白质印迹法检测LC3、p62和LAMP-2蛋白表达，以β-actin作为内参。最后用ECL化学发光，X线片曝光、显影、定影。应用Bio-Rad的胶片灰度分析软件扫描条带，以目的条带与内参条带的灰度值比表示蛋白相对表达量。

四、统计学处理

结 果

一、小鼠胰腺组织病理学变化

对照组小鼠胰腺组织未见明显病理改变(图1A)； AP组小鼠胰腺腺泡水肿，腺泡结构破坏、消失，叶间隔、小叶间隔及腺泡间隔显著增宽，腺泡细胞呈不同程度变性坏死(图1B)。AP组4项病理评分均显著高于对照组，差异有统计学意义(表1)。

二、小鼠胰腺组织中LC3、p62和LAMP-2蛋白表达量的变化

对照组胰腺组织LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ蛋白表达及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值分别为0.83±0.03、0.20±0.02、0.24±0.02，AP组分别为0.41±0.07、0.48±0.09、1.16±0.08，AP组LC3-Ⅰ的表达低于对照组，LC3-Ⅱ表达高于对照组，而LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值显著高于对照组，差异有统计学意义(t=14.05，P<0.05，图2A)。AP组胰腺组织p62蛋白表达量为0.94±0.04，显著高于对照组的0.34±0.03(t=21.77，P<0.05，图2B)；LAMP-2蛋白表达量为0.35±0.04，显著低于对照组的0.95±0.03(t=13.60，P<0.05，图2C)，差异均有统计学意义。

图1 对照组(1A)、AP组(1B)小鼠胰腺组织的病理改变(HE ×100)

组别只数水肿炎症出血坏死总评分对照组1000000AP组103.13±2.83±3.25±3.16±12.37±0.500.320.460.471.75t值17.2515.2221.2320.1518.25P值<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01

讨 论

尽管近年来有关AP的发病机制和临床诊疗相关的研究有了一定的进展，但AP尤其是重症急性胰腺炎(SAP)依然是临床非常常见且严重危及患者生命的急性炎症性疾病。最近有研究表明自噬活性的异常与AP密切相关[10-11]。Mareninova等[10]发现溶酶体中成熟的CatB和CatL减少，且分解功能下降，导致大量酶原堆积在自噬溶酶体内，引起酶原激活和细胞损伤，从而引起AP。Ohmuraya等[11]通过诱导AP小鼠腺泡细胞内自噬体形成，发现胰蛋白酶原大量激活，导致胰腺细胞死亡,阻断或抑制自噬体大量形成可减轻AP的严重程度。因此，自噬已成为目前探讨AP发生发展研究的新靶点。

本研究采用腹腔注射L-精氨酸建立AP小鼠模型，结果显示AP组小鼠胰腺腺泡水肿及腺泡结构破坏、消失, 叶间隔、小叶间隔及腺泡间隔显著增宽, 腺泡细胞呈不同程度变性坏死，组织病理评分显著高于对照组，表明腹腔注射L-精氨酸制模成功。

LC3有Ⅰ型和Ⅱ型之分。LC3-Ⅱ结合于自噬体膜上，其含量与自噬体数量呈正比[3]。本研究结果显示对照组LC3-Ⅰ表达高于LC3-Ⅱ表达，而AP组LC3-Ⅰ表达低于LC3-Ⅱ。AP组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值显著高于对照组，提示AP组自噬体数量较对照组增加。自噬体数量增加源于两种可能，一种是自噬被激活，另一种是自噬体与溶酶体融合障碍导致自噬体积累。早期研究发现p62可与LC3-Ⅱ形成复合物，并将蛋白质转运至自噬溶酶体内降解。因此，p62蛋白水平与自噬溶酶体的数量呈反比[6-7]。本结果显示AP组p62蛋白表达显著高于对照组，提示AP组自噬溶酶体数量减少。因此，推断AP组自噬体积累是由于自噬体与溶酶体融合障碍而导致的。

图2 对照组(1)、AP组(2)小鼠胰腺组织LC3(2A)、p62(2B)及LAMP-2(2C)蛋白的表达(蛋白质印迹法)

为进一步研究AP时自噬体与溶酶体融合障碍的机制，本研究检测了LAMP-2蛋白表达。结果显示AP组胰腺组织LAMP-2蛋白表达较对照组显著下降，提示AP组自噬体与溶酶体融合障碍可能与其胰腺组织LAMP-2蛋白表达降低有关。但LAMP-2蛋白表达下调的机制有待进一步研究。

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(本文编辑：冀凯宏)

中国医师协会胰腺病专业委员会慢性胰腺炎学组成立

慢性胰腺炎是消化系的疑难病，患者除了饱受病痛折磨，往往也面临着长期的诊疗费用支出。慢性胰腺炎不仅需要全社会的关爱，更需要长期的、科学的、精准的诊疗服务。

2017年8月11日，中国医师协会胰腺病专业委员会慢性胰腺炎学组成立仪式在上海举行，上海长海医院消化内科廖专教授当选首任学组组长。

慢性胰腺炎学组是我国首个慢性胰腺炎多学科学术交流平台，它整合了我国消化内科、普通外科、病理学、影像医学等相关领域临床和科研资源，旨在大力推动我国慢性胰腺炎基础研究发展，全面提升诊疗服务水平。

中国医师协会胰腺病专业委员会主任委员李兆申教授对学组的成立表示祝贺并寄予了殷切的希望，他提出慢性胰腺炎基础研究和诊疗模式探索在我国起步较晚，学组的成立为相关领域的医学人才搭建了良好的沟通与合作平台，有利于通过临床总结与科研创新的双向转化，将创新理念与流程优化的有机融合，落实和推进规范化的诊断和治疗，加强对该病特殊类型的认识，有助于进一步提高我国慢性胰腺炎的诊治水平，造福广大慢性胰腺炎患者。

首任学组组长廖专教授所在的长海医院通过整合各学科优势医疗资源，建立长海胰腺疾病多学科团队，聚焦慢性胰腺炎基础研究和诊疗模式探索，逐渐形成了极具特色的慢性胰腺炎治疗“长海模式”。2010年，长海医院在国内率先开展胰腺结石体外震波碎石术(P-ESWL)，并创建“药物-胰管碎石-内镜治疗-外科手术”MEES治疗新体系。至2017年，学科团队通过ESWL术治疗胰管结石超过5 000例次，显著提高治疗水平和患者的生存质量。传统外科手术和后期观察的费用一般在6～7万，还不包括并发症后引起的二次治疗；而体外震波碎石等微创诊疗技术所需要的费用仅仅为原来的十分之一。为服务广大患者，长海医院开设了慢性胰腺炎专病门诊，近5年专病门诊量突破1.3万人次。开设院前检查绿色通道，方便患者就诊。

Expression and significance of autophagy-related genes in acute pancreatitis

Li Xia, Yu Xiao, Yu Can, Li Zhiqiang, Han Duo, Huang Hui, Shang Mingming, Zhu Hongwei.

Department of Endocrinology, Third Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410013, China

Zhu Hongwei, Email: zhuhongweizhw1987@126.com

Objective To examine the expression and analyze the significance of autophagy-related gene microtubule-associated protein 1 light chain 3 (MAP1-LC3, LC3), p62 and lysosome-associated membrane protein 2 (LAMP-2) in pancreatic tissues of mice with acute pancreatitis (AP). Methods Twenty mice were randomized into AP group and control group, and the number of mice was equal between two groups. AP group was intra-peritoneally injected by 20% L-arginine solution (two injections of 4 g/kg body weight, every 1 h) in the dosage of 4 g/1 kg twice every 1 hour to establish AP model, while control group was administered with equal volume of normal saline by intra-peritoneal injection. All the mice were euthanized at 24 hour after the last injection. Pancreatic histopathological changes were measured. In addition, the protein expressions of LC3, p62 and LAMP-2 were detected by Western blot. Results No obvious pathological changes were observed in control group. Pancreatic acinar edema, structure destruction, missing, the obvious widening of interlobular septum, small interlobular septum and acinar septum, and the necrosis of acinar cells at different degrees were observed in AP group. The pathological score for tissue edema, hemorrhage, necrosis and inflammation in AP group was 3.13±0.50, 2.83±0.32, 3.25±0.46 and 3.16±0.47, respectively, which was all 0 in control group. The differences were statistically significant between AP group and control group (P<0.01). In AP group, the ratio of LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ, p62 and LAMP-2 protein in pancreatic tissue were 1.16±0.08, 0.94±0.04 and 0.35±0.04, respectively, which were 0.24±0.02, 0.34±0.03 and 0.95±0.03 in control group. The ratio of LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ and p62 protein in pancreatic tissue in AP group were much higher than those in control group, while LAMP-2 in AP group was lower than that in control group, and there was statistically significant difference between two groups (allP<0.01). Conclusions Intra-peritoneal injection of L-arginine could induce acute pancreatitis, and autophagy is impaired, which was associated with decreased LAMP-2 protein expression.

Pancreatitis; Autophagy; Microtubule-associated proteins; p62; Lysosomal-associated membrane protein 2

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2017.04.002

410013 长沙，中南大学湘雅三医院内分泌科(李霞)，肝胆胰外科(余枭、李志强、韩铎、黄珲、尚明铭、朱红伟)，重症监护室(余灿)

朱红伟，Email：zhuhongweizhw1987@126.com

国家自然科学基金(81570585)；湖南省自然科学基金(2015JJ6114)；湖南省科技厅社会发展支撑计划(2014FJ6043)

2017-05-11)