王言森 ，曹洪丽

(1山东省交通医院，济南250013；2首都医科大学附属北京康复医院)

肺腺癌组织中PI3K、p-AKT1蛋白表达的变化及意义

王言森1，曹洪丽2

(1山东省交通医院，济南250013；2首都医科大学附属北京康复医院)

目的 观察肺腺癌组织中磷酸肌醇3激酶(PI3K)、活化的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(p-AKT1)表达水平及微血管密度(MVD)的变化，并探讨其三者之间及与患者临床病理特征、总生存期的关系。方法 接受根治性手术切除治疗的肺腺癌患者129例，取其癌组织及癌旁组织，利用免疫组化法检测组织中PI3K、p-AKT1蛋白表达及MVD，分析各指标之间及与患者临床病理特征、总生存期的关系。结果 癌组织与癌旁组织PI3K蛋白表达阳性率分别为66%和19%， p-AKT1蛋白表达阳性率分别为52%和11%，二者在癌组织中的表达均高于癌旁组织(P均<0.05)。癌组织MVD高于癌旁组织(P<0.01)。PI3K、p-AKT1蛋白表达水平及MVD与临床分期、分化程度、淋巴结转移有关(P均<0.05)。PI3K、p-AKT1蛋白高表达者总生存期短于低表达者(P均<0.05)。PI3K、p-AKT1蛋白高表达者MVD高于低表达者(P均<0.05)。结论 肺腺癌组织中PI3K、p-AKT1水平升高，其可促进肿瘤微血管形成，参与肿瘤的发生发展，且与患者预后有关。

肺腺癌；磷脂酰肌醇3激酶；蛋白激酶B;微血管密度

肺癌是人类死亡的主要原因，肺腺癌是肺癌中发病率最高的病理类型。磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(也称AKT)信号通路参与多种肿瘤发生发展过程，PI3K/AKT的活化可以引发下游信号分子的过度活化，从而促进肿瘤血管生成、细胞增殖、抑制细胞凋亡。但是该通路在肺腺癌组织中的研究相对较少。本研究中，我们了观察肺腺癌组织中PI3K、活化的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(p-AKT1)蛋白表达及MVD的变化，并探讨了其三者之间及与临床病理特征、总生存期的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2008年1月1日～2011年1月1日在山东省交通医院接受根治性手术切除治疗的肺腺癌患者129例，均经病理学检查确诊，符合1999年世界卫生组织中肺肿瘤诊断标准。其中男78例、女51例，年龄33～82岁、中位年龄48.4岁。吸烟者89例、不吸烟者40例。TNM分期中Ⅰ期54例、Ⅱ期37例、Ⅲ期38例；出现淋巴结转移77例、无淋巴结转移52例。纳入标准：初治未经放化疗者；无远处转移、接受根治性切除手术；病理确诊为肺腺癌，且本研究中复验病理也为肺腺癌；病例资料完整、肿瘤组织蜡块标本于本院病理科保存完整等。排除复治者；经过放化学治疗者；有远处转移者；病例资料不完整者。

1.2 组织PI3K、p-AKT1蛋白表达及MVD的检测 术后10 min内取患者肿瘤部位以及癌旁部位组织(距离癌组织>5 mm)，经10%甲醛固定，石蜡包埋制成病理蜡块，首先进行苏木精-伊红染色，阅片明确肿瘤的类型、分化程度、浸润深度等，并与原始病理资料作比较。确定为癌以及癌旁组织后，将相应蜡块切片进行免疫组化染色。具体步骤为：切片后恒温60 ℃烤片12 h；二甲苯及梯度乙醇脱蜡；高压抗原修复；过氧化氢阻断内源性过氧化物酶活性；山羊血清封闭；分别滴加抗PI3K一抗(稀释比例1∶200)、抗p-AKT1一抗(稀释比例1∶200)、CD34一抗(稀释比例1∶150)，湿盒孵育；二抗孵育；滴加SP液；DAB显色；自来水冲洗终止显色；苏木素复染细胞核；梯度乙醇脱水；封片；显微镜下观察染色结果。高倍镜(×200)下计数CD34染色阳性的微血管数目，计算每平方米中微血管数目，取3个数的平均数作为该病例的MVD值。将全部病例的中位MVD值17(6～42)作为分界，分为低MVD组和高MVD组。

1.3 阳性结果判定 采用双盲法，由两位病理科医师分别独立对石蜡切片在光学显微镜下进行观察。PI3K蛋白阳性染色为胞质内黄色颗粒沉着，p-AKT1蛋白阳性染色为胞质和(或)细胞核着棕黄色或棕褐色，高倍视野(×400)下随机选取3个清晰视野，计算阳性细胞占细胞总数的百分比，并取均值。依照染色强度评分：无着色为0分，着浅黄色为1分，着棕黄色为2分，着褐色为3分；依照阳性细胞百分比评分：<10%为0分，10%～25%为1分，﹥25%～50%为2分，>50%为3分。两种分数相乘得到最终染色评分，其中PI3K评分中位数为6分，p-AKT1评分中位数为4分，分别将PI3K和p-AKT1的染色评分中位数作为分界，分为低表达和高表达组，并进行后续的数据分析。

1.4 随访 截止随访日期2016年6月23日，患者中位生存期为35.8个月，5年生存率为18%，其中Ⅰ期患者50%以上存活，Ⅱ期患者中位生存期39.1个月，Ⅲ期患者中位生存期15.8个月。截止至随访日期，23例患者仍生存。根据确诊时间和死亡时间计算总生存期(OS)。

2 结果

2.1 癌组织与癌旁组织PI3K、p-AKT1蛋白表达及MVD的比较 癌组织与癌旁组织PI3K蛋白表达阳性率分别为66%(86/129)和19%(25/129)， p-AKT1蛋白阳性率分别为52%(68/129)和11%(15/129)。癌组织中的两种蛋白的表达高于癌旁组织(P均<0.05)。癌组织与癌旁组织MVD值分别为(17.56±6.4)、(3.56±0.2)个/mm2，癌组织中MVD高于癌旁组织(P<0.01)。

2.2 癌组织PI3K、p-AKT1蛋白表达及MVD与肺腺癌患者临床病理特征的关系 PI3K蛋白阳性染色为胞质内黄色颗粒沉着，p-AKT1蛋白阳性染色为胞质和(或)细胞核着棕黄色或棕褐色。CD34表达于微血管内皮细胞，阳性呈棕黄色。相对于高或中分化、肿瘤分期Ⅰ～Ⅱ期及无淋巴结转移患者，低分化、肿瘤分期Ⅲ期、有淋巴结转移的患者中，PI3K、p-AKT1蛋白表达高，MVD高(P均<0.05)。

表1 癌组织PI3K、p-AKT1蛋白表达及MVD与肺腺癌患者临床病理特征的关系(例)

2.3 不同PI3K、p-AKT1蛋白表达水平及MVD患者生存期比较 PI3K高表达组的中位总生存期为26.4个月，低表达组为36.3个月，两组比较，P=0.013。p-AKT1高表达组的中位生存期为25.4个月，低表达组为33.7个月，两组比较，P=0.019。高MVD组的中位生存期为24.9个月，低MVD组为38.3个月，两组比较，P=0.001。见图1。

2.4 不同PI3K、p-AKT1蛋白表达水平肺腺癌患者MVD比较 肺腺癌PI3K高表达者癌组织中MVD为(23.87±9.70)个/mm2，低表达者(12.37±4.50)个/mm2。PI3K高表达者MVD高于低表达者(t=-6.234，P<0.01)。肺腺癌p-AKT1高表达者癌组织中MVD为(21.54±7.90)个/mm2，低表达者(15.79±6.30)个/mm2。p-AKT1高表达者MVD高于低表达者(t=-3.234，P<0.05)。

3 讨论

肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤[1]，严重威胁全世界人口的健康和生命。PI3K/AKT信号通路是肿瘤研究的热门通路，在多种肿瘤组织内均发现该通路中蛋白表达失调。PI3K有两种激活方式[2]，一种是与具有磷酸化酪氨酸残基的生长因子受体或连接蛋白相互作用, 引起二聚体构象改变而被激活；另一种是通过Ras和p110直接结合导致PI3K活化。PI3K活化的结果是在质膜上产生第二信使PIP3，PIP3与细胞内含有PH结构域的信号蛋白AKT和PDK1结合，促使AKT蛋白的Ser308位点磷酸化而被激活。既往研究证明，PI3K信号级联反应通路在非小细胞肺癌的发生发展中起重要作用[3,4]，这一通路促进多种与肺癌细胞生长和繁殖相关的细胞功能，如细胞增殖、迁移和血管生成[5]。AKT1是PI3K途径中重要的分子，活化的AKT1可以磷酸化下游多个细胞激酶[6]，从而调节细胞凋亡和蛋白质的翻译等。PI3K/AKT途径在肺腺癌中被激活，并与低分化、进展期和淋巴结转移等相关。而高PI3K/AKT通路高度活化的肺腺癌患者生存率降低。本研究中，肺腺癌组织内PI3K表达与肿瘤分期、分化程度、淋巴转移有相关性，且PI3K表达水平是影响肺腺癌患者预后的影响因素，提示PI3K与肺癌的发生发展有关。

图1 不同PI3K、p-AKT1表达水平及MVD的肺腺癌患者生存曲线(Kaplan-Meier法)

AKT是一种57 kD的丝氨酸/苏氨酸激酶，哺乳动物体内含有3种AKT基因，分别为AKT1、AKT2和AKT3。其中AKT1基因定位于染色体14q32位置，且在脑组织、心脏组织和肺组织中表达最多，故本研究采用AKT1蛋白进行研究。磷酸化的AKT1从细胞膜附近转移到细胞质和细胞核，可调控下游蛋白的磷酸化来控制细胞的凋亡、侵袭、血管生成等过程。有研究证实，在人支气管上皮细胞发生恶变之前AKT的活化程度即开始增高。AKT还可通过p53上的结合蛋白磷酸化而促进p53降解，进而抑制细胞凋亡；可促使细胞周期蛋白cyclinD1降解，也可抑制p21，促进细胞从G1期进入S期，促进细胞增殖；通过抑制细胞凋亡，促进细胞增殖，从而增强肿瘤细胞的增殖能力。本研究中，p-AKT1与肺腺癌的组织分化程度、临床分期和淋巴转移相关，且是肺腺癌预后的影响因素之一，可见PI3K/AKT通路可促进肺腺癌的发生发展。

异常血管的形成是实体肿瘤发生发展的重要步骤。1971年Folkman首次提出肿瘤依赖新生血管生长。血管生成理论认为，肿瘤早期需要通过弥散作用获得营养，随着肿瘤体积增长，需要形成新生血管来获得其生长所需要的养分。研究证明，PI3K/AKT通路参与肿瘤异常血管生成的过程。AKT激活后，促使c-Jun/AP-1蛋白耦联并结合到COX-2启动子相应位点上，促使COX-2转录表达，并促进前列腺素E2的生物合成和释放，从而促进血管形成。AKT活化后通路还可上调氧诱导因子1α(HIF-1α)，HIF-1α可促进强效促血管生成剂血管内皮生长因子的合成和分泌，促使血管形成。本研究中，PI3K和p-AKT高表达者，MVD高，提示在肺腺癌中PI3K/AKT信号转导通路参与肿瘤新生血管生成，从而影响患者的生存期。PI3K/AKT影响肺腺癌患者异常血管生成的具体机制仍需要进一步研究，目前针对PI3K/AKT通路的抑制肿瘤药物仍在研发过程中，需要更多的科研实验以及临床实验探索达到延长肺腺癌患者生存的目的。

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曹洪丽(E-mail：343997118@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.29.022

R734.2

B

1002-266X(2017)29-0065-03

2017-05-03)