张峥，张戈，杨蓉，龙宣杞

(1.新疆大学生命科学与技术学院，乌鲁木齐 830052；2.新疆维吾尔自治区科技发展战略研究院乌鲁木齐 830052；3.新疆农科院微生物应用研究所，乌鲁木齐 830091)

培养基不同营养水平对一株植物乳杆菌发酵生长及保存的影响

张峥1，张戈2，杨蓉3，龙宣杞3

(1.新疆大学生命科学与技术学院，乌鲁木齐 830052；2.新疆维吾尔自治区科技发展战略研究院乌鲁木齐 830052；3.新疆农科院微生物应用研究所，乌鲁木齐 830091)

【目的】研究培养基营养水平对一株植物乳杆菌生长以及对菌液保存过程中活菌数的影响，为植物乳杆菌的发酵生产和保存提供理论参考。【方法】用分光光度仪测定液体振荡培养条件下，植物乳杆菌的生长曲线，并确定在培养基不同营养水平下植物乳杆菌的对数生长末期、平稳期中期、平稳期末期，用硫酸-蒽酮法测定相应的残糖含量和活菌数，并测定液体振荡培养后静置保存过程中的活菌数。【结果】在30 h的液体振荡培养中，植物乳杆菌在富营养、正常和寡营养三种营养水平条件下，该菌的生长曲线都经历了迟缓期、对数期、稳定期，未见到衰亡期。寡营养水平下，植物乳杆菌最大活菌数达到最高水平，达到1012cfu/mL以上。在静置过程中，三种发酵培养液中活菌数持续下降。在静置30 d时，三种水平下的活菌数都保持在1010cfu/mL以上。在此之后，寡营养和正常水平培养基中活菌数快速下降，而富营养培养基中活菌数仍处于较高水平，直至静置60 d后仍保持在1010cfu/mL以上。【结论】三种营养水平下，植物乳杆菌生长曲线类似，在寡营养水平下，发酵液中的活菌数最高，富营养水平则更有利于发酵液中活菌的长时间保存。在进行液体深层发酵生产时，可以采用寡营养水平，以利于提高活菌数；发酵完成后可补充营养利于活菌的保存。

植物乳杆菌；生长曲线；菌液保存

0 引 言

【研究意义】植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)属于乳杆菌科中的乳杆菌属，革兰氏阳性，最适生长温度为30～35℃，厌氧或兼性厌氧,菌种为直或弯的杆状，单个、有时成对或成链状，最适pH 6.5左右，属于同型发酵乳酸菌。植物乳杆菌对人体有特殊的生理作用, 且在食品[1]、 饲料[2、3]及医疗保健[4]领域中占重要地位。随着科学的发展, 研究的不断深入, 人类对植物乳杆菌生理功能的研究发现在不断增多, 使用乳杆菌菌株的范围也在不断扩大, 其应用领域也在不断增多。【前人研究进展】我国从20世纪50年代开始对植物乳杆菌相关的基础理论及应用进行研究，进入21世纪后更是成为了研究热点。目前，通过各个方面对植物乳杆菌的生长和保存进行研究。华宝珍等[5]通过单因素试验分析了大豆多肽添加量、葡萄糖酸锰添加量、嗜热链球菌的接种量和发酵温度对植物乳杆菌ST-Ⅲ活菌数的影响。刘书亮等[6]对植物乳杆菌P158进行了生长曲线分析，发现培养36 h时生物量达到最大值,约为1011cfu/mL。余乐[7]报道了植物乳杆菌发酵剂的贮藏温度和贮藏时间对菌体存活率的影响。司淼菲[8]研究了喷雾干燥法和真空冷冻干燥法对制备植物乳杆菌直投式发酵剂的影响,结果表明真空冷冻干燥法制备的植物乳杆菌直投式发酵剂的菌种存活率、储藏性和活菌数含量都较高。【本研究切入点】随着植物乳杆菌应用领域的不断扩大，它在加工、运输过程中的失活问题也日益突出[9]，制约了其在生产生活中的应用。通过对菌株培养基营养水平的改变,研究营养水平对植物乳杆菌生长和保存的影响。【拟解决的关键问题】研究培养基营养水平对一株植物乳杆菌生长以及对菌液保存过程中活菌数的影响，寻找有利于其生长和保存的营养水平，为植物乳杆菌的应用提供一定的基础资料。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株

实验菌株植物乳杆菌由新疆农业科学院微生物应用研究所提供。

1.1.2 培养基与试剂

正常水平发酵培养基：蔗糖 20 g，酵母粉 12 g，蛋白胨 10.5 g，磷酸二氢钾 0.2 g，硫酸镁 0.2 g，硫酸锰 0.04 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0；

寡营养发酵培养基：正常水平降低25%；

富营养发酵培养基：正常水平升高25%；

MRS固体培养基：蔗糖 20 g，酵母粉 12 g，蛋白胨 10.5 g，磷酸二氢钾 0.2 g，硫酸镁 0.2 g，硫酸锰 0.04 g，琼脂 20 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0；

蒽酮试剂：溶解0.2 g蒽酮于100 mL浓硫酸(A.R.95.5%)中，当日配制使用。

标准糖试剂：0.1 g/L葡萄糖溶液。

1.1.3 主要仪器

高压蒸汽灭菌锅MLS-3020(新德医疗器械有限公司)，紫外分光光度计UV-2550(日本岛津自动化设备有限公司)，摇床ZHWY-100D(上海智城仪器制造有限公司)，DK-8D电热恒温水槽(上海精宏实验设备有限公司)：PHs-3C酸度计(上海雷磁仪器厂)，AEL_160岛津电子天平(日本岛津自动化设备有限公司)，电热恒温培养箱DHP-9162(上海-恒科学仪器有限公司)，超净工作台SW-CJ-2FD(上海精密仪器仪表有限公司)，CP214通用型分析天平(山东博科生物产业有限公司)。

1.2 方 法

1.2.1 菌种活化

将在-20℃保存的菌种于冰浴中溶解， 然后用无菌接种环在MRS固体培养基中划线培养，于35℃恒温培养箱中培养5～7 d ，使菌种复壮。将复壮后的菌种接种至多只MRS斜面培养基上，在35℃恒温培养箱中培养24 h。将斜面置于4℃冰箱中备用。

1.2.2 生长曲线测定

向备用斜面中加入7 mL灭菌水。将菌体充分混匀后，分别向富营养、正常和寡营养水平的200 mL 发酵培养基中加入2 mL菌液，于35℃、120 r/min条件下，发酵培养30 h。在培养过程中，每2 h(2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26 h、......)分别取样，总菌数用分光光度法(波长600 nm)测吸光度值(OD)，以相应的空白培养基溶液为对照，每次三个重复。以时间为横坐标，吸光度值为纵坐标，制作生长曲线。根据生长曲线确定三种不同营养水平下植物乳杆菌的对数生长末期、平稳期中期、平稳期末期。

1.2.3 残糖量的测定

葡萄糖标准曲线测定：分别取0.1 g/L的葡萄糖溶液0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.60、0.80 mL，用蒸馏水补到1.0 mL，对照加入1.0 mL蒸馏水，分别加入4.0 mL蒽酮试剂，迅速进入冰水中冷却，各管加完后一起浸入沸水浴中，管口加盖玻璃球，以防蒸发。自水浴重新煮沸开始计时，准确煮沸10 min。冷却后，用分光光度法(波长620 nm)测吸光度值(OD)。以光密度为纵坐标，糖的含量微克数为横坐标，制作标准曲线。

用与1.2.2相同的方法，将菌种接种至200 mL 三种发酵培养基中，于35℃、120 rmp条件下进行培养。在1.2.2中确定的各个时间点取样，测其OD值。并取1.0 mL样品溶液，进行1 000倍稀释后，取稀释液1.0 mL，一式3份分别置于不同试管中，对照加入1.0 mL蒸馏水，然后给各管加入4 mL蒽酮试剂，以标准曲线方法进行比色测定。根据标准曲线和样品OD值计算残糖含量。

1.2.4 不同营养水平下生长及保存中菌液活菌数测定

不同培养基浓度下，在植物乳杆菌生长的对数期末期、平稳期中期、平稳期末期分别吸取1 mL菌液至9 mL灭菌水的试管中，摇匀，做梯度稀释至10-9，取10-7、10-8、10-9梯度进行涂布，35℃培养18 h，计数，确定菌液中的活菌数。此后，将发酵菌液常温下静置，分别在10、20、30、45和60 d以相同方法测定活菌数。

2 结果与分析

2.1 植物乳杆菌在三种营养条件下的生长曲线

植物乳杆菌的生长周期一般分为调整期、对数期、稳定期和衰亡期。从图1中可以直观地看出，植物乳杆菌在寡营养和正常水平培养基下，调整期为0～4 h，之后进入对数期，至12 h以后进入稳定期，培养到30 h未见到衰亡期；植物乳杆菌在富营养条件下，调整期同样是0～4 h，对数期稍有延长，为4～14 h，14 h以后进入稳定期，培养至30 h也未见到衰亡期。在稳定期，寡营养条件下植物乳杆菌活菌数一直处于最高水平；在稳定期中后期，富营养和正常水平下活菌数相当。活化后的植物乳杆菌在不同营养水平的发酵培养基中表现的生长曲线差异并不显著，但在同样条件下寡营养更适合植物乳杆菌的生物量积累。

可以选定寡营养和正常水平下，LP-2对数生长末期、平稳期中期、平稳期末期分别为12、21、30 h；富营养水平下，LP-2对数生长末期、平稳期中期、平稳期末期分别为14、22、30 h。图1

图1 植物乳杆菌在三种营养条件下生长曲线
Fig.1 Growth curve ofLactobacillusplantarumunder three nutrient

2.2 植物乳杆菌在三种营养条件下的残糖含量

根据葡萄糖标准曲线测定方案，绘制出葡萄糖标准曲线，由图中可知，其拟合方程为：

Y=0.006 5X,R2=0.995 6

其中Y为吸光值OD520，X为葡萄糖含量(μg/mL)。图2

研究表明，在三种营养水平的发酵培养基中，残糖浓度随着植物乳杆菌的生长而降低，其中在寡营养水平下，葡萄糖浓度下降最多，富营养次之，正常水平降低最少。这与三种营养水平下植物乳杆菌的生长曲线表现一致。图3

图2 葡萄糖标准曲线
Fig.2 Standard curve of glucose

图3 植物乳杆菌三个生长期残糖含量
Fig.3 Residual sugar content ofLactobacillusplantarumduring three growing periods

2.3 不同营养水平下生长及保存中菌液活菌数

根据2.1中所测生长曲线结果显示，选定寡营养和正常水平下，植物乳杆菌对数生长末期、平稳期中期、平稳期末期分别为12、21、30 h；高浓度条件下，对数生长末期、平稳期中期、平稳期末期分别为14、22、30 h。

在对数生长末期、平稳期中期、平稳期末期分别对三种营养水平下的植物乳杆菌进行平板计数。平板计数结果为三种浓度水平的三个时期，其活菌数都在1011cfu/mL以上。寡营养条件下，活菌数一直处于最高水平，并在稳定期中期达到1012cfu/mL以上。这与残糖测定结果和生长曲线表现都一致，说明了寡营养更适合植物乳杆菌的生长。图4

经过30 h的震荡培养后，植物乳杆菌活菌数随静置时间的变化可以直观的看到，随着静置时间的延长，三种营养水平下的其活菌数都出现下降。寡营养水平下，植物乳杆菌的起始活菌数最高，其活菌数变化也最显著，其次为正常水平，富营养水平菌体数量变化缓慢。在静止30 d时，三种营养水平下，植物乳杆菌活菌数都处于1010cfu/mL以上；之后，寡营养和正常水平下其活菌数下降至1010以下，而富营养水平下，其活菌数直到静止60 d时活菌数仍保持在1010以上。因此，富营养水平更有利于植物乳杆菌的长时间保存。图5

图4 植物乳杆菌三个生长期活菌数
Fig.4 The viable cell count ofLactobacillusplantarumduring three growing periods

图5 保存过程中植物乳杆菌活菌数
Fig.5 The viable cell count ofLactobacillusplantarumduring storage

3 讨 论

培养基是人工配制的供微生物生长繁殖和合成各种代谢产物所需的、一定比例的多种营养物质的混合物。它的组成对菌体的生长繁殖、产物的生物合成、产品的分离精制乃至产品质量和产量都有重要影响。目前，已有大量培养基对植物乳杆菌生长及保存影响方面的研究[10、11]。从培养基营养水平角度研究其对植物乳杆菌生长和保存的影响。生长曲线、活菌计数以及葡萄糖含量变化的研究结果都表明寡营养水平更适合于植物乳杆菌的生长。因此，在生产中可以采用寡营养浓度培养基，以降低生产成本。研究中植物乳杆菌在寡营养条件下12 h即达到对数生长期末期，与刘书亮等[5]的研究结果22 h和杨永亮等[12]的研究结果18 h均有很大差异，这可能与菌种、培养基、接种量以及培养条件都有关系，有待于进一步的研究。

在发酵液保存过程中会出现活菌数下降的现象，实验针对此现象研究不同营养水平对活菌数的影响。结果发现，在静置过程中，三种营养水平下植物乳杆菌活菌数持续下降，但在富营养条件下活菌数下降趋势较缓，且一直处于较高水平。因此，富营养水平更利于植物乳杆菌发酵液的长期保存。但这与研究中寡营养水平更适合于其生长的结论不一致。因此，应当根据实际需要选择合适的营养水平进行生产或保存。

4 结 论

在30 h的液体振荡培养中，植物乳杆菌在三种营养水平条件下的生长曲线类似，都经历了迟缓期、对数期、稳定期，未见到衰亡期。寡营养水平下，植物乳杆菌在12 h即达到对数生长期末期，并且最大活菌数处于最高水平，达到1012cfu/mL以上。在静置过程中，三种发酵培养液中活菌数持续下降。在静置30 d时，三种水平下的活菌数都保持在1010cfu/mL以上。在此之后，寡营养和正常水平培养基中活菌数快速下降，而富营养培养基中活菌数仍处于较高水平，直至静置60 d后仍保持在1010cfu/mL以上。由此可知，培养基不同营养水平对植物乳杆菌发酵生长及保存的存在影响。在寡营养水平下，发酵液中的活菌数最高，富营养水平则更有利于发酵液中活菌的长时间保存。在进行液体深层发酵生产时，可以采用寡营养水平，以利于提高活菌数；在生产结束前可向发酵液中补充营养，以便于活菌的保存。

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Effects of Different Nutritional Levels on the Growth and Preservation of a Strain Medium：Lactobacillusplantarum

ZHANG Zheng1, ZHANG Ge2, YANG Rong3, LONG Xuan-qi3

(1.CollegeofLifeScienceandTechnology，XinjiangUniversity，Urumqi830046，China； 2.XinjiangAcademyofScienceandTechonlogyforDevelopment，Urumqi830046，China； 3.ResearchInstituteofAppliedMicrobiology,XinjiangAcademyofAgriculturalSciences，Urumqi830091，China)

【Objective】 The purpose of this study is to investigate the effects of nutrient level on the growth and viability of a strain ofLactobacillusplantarum, and to provide theoretical reference for the production and preservation ofL.plantarum.【Method】The growth curve ofL.plantarumunder liquid shake culture was measured with spectrophotometer in order to determine the end of logarithmic phase, the meddle and the late of stationary phase under different nutrient levels. The corresponding residual sugar content was determined by the sulfuric acid-anthrone method, and viable count in the process of saving was also measured.【Result】In the period of 30 hr and under liquid shake culture condition, the growth curve of the bacterial was observed with a lag phase, logarithmic phase and s
Table phase, but decline phase was not found in all nutritional conditions. The highest level of viable count occurred under the nutrient level of oligotrophic, which was 1012cfu/mL. During standing preservation after liquid shake culture, viable count continued to decline in the three fermentation broths, which remained above 1010cfu/mL at 30thday. But after that, viable count in the oligotrophic and normal medium decreased rapidly, while it was still at a high level and remained above 1010cfu/mL even after being saved for 60 days in the eutrophic medium.【Conclusion】The results showed that the growth curves ofL.plantarumwere similar under the three nutrient levels. The highest level of viable count occurred under the oligotrophic level, while the eutrophic level was more favorable for the preservation of viable bacteria. Therefore, the oligotrophic level can be used for fermentation to increase viable count, and nutrition can be added after fermentation to facilitate the preservation of viable bacteria.

Lactobacillusplantarum; growth curve; bacteria preservation

LONG Xvan-qi (1969- ), female, native place: Sichuan. Researcher, research field: Soil Microorganism and Microecology. (E-mail) longxq_xj@sina.com.

10.6048/j.issn.1001-4330.2017.06.018

2017-04-11

自治区科技成果转化专项资金项目“设施农业多价复合菌剂的示范推广”(201554113) ；新疆农业科学院青年基金项目(xjnkq-2015027)

张峥(1991-)，男，河南人，硕士研究生，研究方向为食品生物技术，(E-mail)1132641757@qq.com

龙宣杞(1969-)，女，四川人，研究员，研究方向为土壤微生物与微生态学，(E-mail)longxq_xj@sina.com

S188

A

1001-4330(2017)06-1108-06

Supported by: Project supported by special fund for transformation of scientific and technological achievements of the autonomous region "demonstration of facility agriculture multivalent microbial agents"(201554113)； the Youth Funds of Xinjiang Academy of Agricultural Sciences (xjnkq-2015027)