赖满香　冯娟　阮志燕

[摘要] 目的 探讨巴戟天多糖含药血清对SD大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）骨向分化过程中核心结合因子ɑ-1（Cbfɑ-1）mRNA表达的影响。 方法 全骨髓贴壁法分离培养SD大鼠BMSCs，采用pNPP法检测不同浓度r巴戟天多糖含药血清（高、中、低）对BMSCs碱性磷酸酶（ALP）活性的影响，并以其最佳作用浓度进行后续实验，后续实验分成空白组、成骨诱导组、巴戟天多糖含药血清组、联合组（巴戟天多糖含药血清组+成骨诱导组），各组用药14d，采用RT-PCR技术检测各组BMSCs Cbfa-1 mRNA表达的情况。 结果 与对照组比较，不同剂量的巴戟天多糖含药血清均可提高BMSCs分泌ALP（F=126.278，P<0.05），其中高剂量组的作用强度高于其它剂量组；与空白组相比，成骨诱导组、巴戟天多糖含药血清组、联合组均能上调BMSCs中Cbfa-1 mRNA的表达（F=261.412，P<0.05）；但与成骨诱导组相比，巴戟天多糖含药血清组不及成骨诱导组，两者差异有统计学意义（t=26.721，P<0.05）。 结论 巴戟天多糖含药血清能够促进BMSCs向成骨细胞分化，并能上调Cbfa-1 mRNA的表达，但其作用不及成骨诱导强。

[关键词] 巴戟天多糖含药血清；骨髓间充质干细胞；碱性磷酸酶；骨向分化；Cbfa-1

[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2017）15-27-04

[Abstract] Objective To investigate the effects of morindae officinalis polysaccharide （MOP） containing serum on Cbfa-1 mRNA expression during the differentiation from BMSCs to the osteoblast. Methods BMSCs were isolated by whole bone marrow adherent method.Different concentrations of MOP-containing serum，including high dosage，middle dosage and low dosage，were added to BMSCs section to detect the alkaline phosphatase （ALP） activity by pNPP method，the best dosage was added to the next experiment.BMSCs were divided into the blank group，the osteogenic induced group，the MOP-containing serum group，MOP-containing serum and the osteogenic induced co-culture group.Cbfa-1 mRNA in each group were detected by RT-PCR at day 14. Results Compared with the control group，different concentrations of MOP-containing serum could elevate serum ALP activities（F=126.278，P<0.05），and the high dosage was the best.Compared with the blank group，Cbfa-1 mRNA expression levels increased in the osteogenic induced group，MOP-containing serum group and co-culture group， difference has statistical significance（F=261.412， P<0.05）.Cbfa-1 mRNA expression levels was lower than the osteogenic induced group， difference had statistical significance（t=26.721，P<0.05）. Conclusion The MOP-containing serum can promote the differentiation of BMSCs to osteoblasts，and increase Cbfa-1 mRNA expression，but its strength is lower than the osteogenic induced.

[Key words] MOP-containing serum；Bone marrow mesenchymal stem cell；Alkaline phosphatase；Osteogenic differentiation；Cbfa-1

巴戟天為茜草科多年生藤植物，为我国著名的四大南之一，现代药理研究证明：巴戟天具有强壮骨骼、调节免疫功能、调节甲状腺功能、抗衰老、抗

疲劳、增强记忆、抗肿瘤及促进造血等作用[1]。巴戟天多糖（morindae officinalis polysaccharide，MOP）为巴戟天的有效成分之一，有实验研究证实，巴戟天多糖具有预防骨质疏松的作用[2-3]，体外能促进成骨细胞增殖，提高成骨细胞分泌ALP与骨钙素，抑制破骨细胞活性[4]，巴戟天提取物能促进MSCs向成骨细胞分化，并能加强Cbfa1的表达[5]，但巴戟天作用于MSCs的具体成分不清。本实验观察巴戟天多糖含药血清对SD大鼠BMSCs向成骨分化过程中核心结合因子ɑ-1（Cbfɑ-1）表达的影响，从干细胞水平探讨巴戟天多糖促BMSCs骨向分化中的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

实验所用动物为清洁级3月龄SD大鼠40只，体重245～255g；清洁级3月龄SD雌性大鼠1只，体重250g，用于BMSCs的提取。所用大鼠均由暨南大学实验动物中心提供（许可证号：SYXK（粤）第2012-0117）。

1.2 仪器、药物与试剂

3111系列CO2培养箱购于美国Thermo Forma公司，SWCJ-1超净工作台购于苏州净化设备有限公司，BPH-300倒置相差显微镜购于日本Nikon公司。9600 PCR扩增仪购于美国PE公司。

巴戟天多糖购于陕西斯诺特生物技术有限公司；ALP测定试剂盒购于南京建成生物工程研究所，Trizol Reagent购于北京赛百盛公司，RT试剂盒购于日本东洋坊。

1.3 实验方法

1.3.1 巴戟天多糖含药血清制备 按照随机数字法将40只大鼠分成4组，每组10只。高剂量组每天给予巴戟天多糖2.5g/kg；中剂量组每天给予巴戟天多糖1g/kg；低剂量组每天给予巴戟天多糖0.5g/kg；对照组不给予药物，每天灌胃生理盐水100mL/kg；每组连续给药7d。

1.3.2 BMSCs细胞的分离、培养和鉴定 采用全骨髓贴壁法，取3月龄SD大鼠拉颈处死，于75%乙醇消毒，取出大鼠股骨，切除股骨兩端骨骺，用PBS液反复冲洗骨髓腔，收集混合液，1500r/min，离心5min，吸走上清液，用含10% FBS的低糖DMEM 培养液重悬细胞，并以5×106/mL的密度将细胞接种到25cm2塑料培养瓶中，置于37℃、体积为5%饱和湿度的CO2恒温培养箱中培养。倒置显微镜下，观察BMSCs在生长过程中的形态变化。取生长良好的第3代细胞，采用流式细胞仪检测细胞表面标志物CD29，CD44，CD45，CD34的表达，以确定是否符合BMSCs的生物特征。

1.3.3 pNPP法检测巴戟天多糖含药血清对BMSCs ALP的影响 取生长良好的第三代BMSCs，分别加入巴戟天多糖含药血清高、中、低剂量组培养液和对照组培养液，连续干预14d。收集各组细胞上清液，采用pNPP法进行ALP含量的测定。并从中选取巴戟天多糖含药血清促BMSCs分泌ALP的最佳剂量应用于后续实验。

1.3.4 RT-PCR检测各组BMSCs Cbfa-1 mRNA的表达 取生长状态良好的第三代BMSCs，分别添加空白组（含15%胎牛血清低糖DMEM完全培养液），成骨诱导组（低糖DMEM 培养液+15%胎牛血清+10-8 mol/L地塞米松+50 mg/L维生素C+10-2mol/Lβ磷酸甘油），巴戟天多糖含药血清组（低糖DMEM培养液+MOP含药血清促BMSCs分泌ALP的最佳剂量）和联合组培养液（MOP含药血清组+成骨诱导组），培养14d后采用RT-PCR检测Cbfa-1 mRNA的表达。以β-actin进行标准化，行半定量分析。

1.4 统计学处理

本研究采用Stata11.0统计软件进行分析，计量资料以（）表示，两两比较采用t检验，多组间比较运用单因素方差分析，计数资料以百分比表示，采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BMSCs的培养及鉴定结果

刚接种的细胞悬浮于培养液中，呈圆形，后48h后逐渐出现贴壁细胞，形态由圆盘状逐渐向外伸出突起而转变短梭形（图1）。72h附壁铺伸细胞数量增多，呈多细胞集落性分布，彼此不相接触。第4、5天开始形成典型的呈均匀分布的MSCs簇状增生灶，且随培养时间的延长，成纤维细胞样集落形成量逐渐增多，细胞形态发生了根本的变化，呈长梭形，紧密排列。第6天后MSCs迅速增殖扩增，不仅成纤维细胞样集落形成数量迅速增加，而且还不断扩大，相互间融合。随着细胞数量增加体积增大，细胞形态趋于一致。10～14d，非附壁细胞经反复换液而消失，细胞90%以上融合，融合细胞都呈梭形，紧密排列类似漩涡状（图2）。第3代细胞经流式细胞仪检测结果显示：CD44、CD29阳性细胞比率分别为97.56%和95.24%，CD45、CD34阳性细胞比率分别为0.57%和0.48%。符合BMSCs的生物学特性。

2.2 巴戟天多糖含药血清对BMSCs ALP的影响

与对照组相比，巴戟天多糖含药血清高、中、低剂量组的ALP 活性均升高，差异有统计学意义（F=126.278，P<0.05），各剂量组作用的强弱：巴戟天多糖含药血清高剂量>巴戟天多糖含药血清中剂量组>巴戟天多糖含药血清低剂量组，结果表明，巴戟天多糖含药血清具有促进BMSCs分泌ALP，其中高剂量组促BMSCs分泌ALP的能力最佳。见表1。

2.3 各组Cbfa-1 mRNA的表达水平

经单因素方差分析结果显示：成骨诱导组、巴戟天多糖含药血清组和联合组的辉度比值高于空白组，差异有统计学意义（F=261.412，P<0.05）；成骨诱导组与巴戟天多糖含药血清组比较，差异有统计学意义（t=26.721，P<0.05）。

3 讨论

骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）起源于骨髓的中胚层，是一种具有多向分化潜能的非造血干细胞，在体外不同的诱导条件下，能分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、肝实质细胞等多种细胞[1]。因其具有取材方便，体外增殖能力强，长期传代不改变生物学特征等优点而广泛应用于骨组织工程中。本实验采用最常用的全骨髓贴壁法[6]进行BMSCs细胞培养。实验结果可见细胞接种后48h内即可贴壁，72h后大部分细胞贴壁生长；细胞首次接种培养10d后即可达到80%以上融合，经过几次传代后，生长的细胞呈形态均一、排列有序的成纤维样细胞。细胞周期检测中可见近90%以上的细胞处于G0/G1期，说明经扩增至P3代的BMSCs 仍有一部分细胞处于相对静止未分化的状态，从而可保证用于后续基因传递的细胞仍保持干细胞特性，符合BMSCs的生物学特性[7]。

BMSCs向成骨细胞分化过程中的重要表现是细胞能够合成、分泌表达成骨特异性的蛋白和细胞外基质分。有研究证明，ALP是早期BMSCs向成骨细胞分化的关键性标志之一[8-9]。ALP是一种钙结合转运蛋白，能促進细胞成熟和钙化[10]，ALP活性越高说明成骨细胞前体细胞向成熟成骨细胞分化越明显。因此ALP在BMSCs骨向分化中扮演重要角色，测定ALP活性变化可以衡量BMSCs骨向分化的成熟程度[11]。本实验选用ALP活性来评价不同剂量的MOP含血清对BMSCs分泌ALP的影响，并以此筛选最佳的促骨向分化浓度，以应用到后续实验。结果显示，不同剂量的MOP含药血清组可增加BMSCs上清液中的ALP的表达与分泌，这说明在此浓度范围内的MOP含药血清能够促进BMSCs向成骨细胞方向分化，其中高剂量MOP含药血清效果最佳。

核心结合因子a（core binding factor alpha 1，Cbfa1）是runt结构域家族成员，其表达仅在骨组织和成骨细胞中检测到[12]。有研究表明Cbfa1是MSCs向成骨细胞分化过程中的一种骨特异性转录因子，为骨形成的关键基因，是成骨细胞分化和功能的中心调控因子，决定着成骨细胞的发生与分化[13]。在敲除Cbfa1基因的小鼠模型实验中发现，缺少此基因可阻碍小鼠成骨细胞分化，抑制小鼠骨骼的软骨内成骨和膜内成骨，而Cbfa1（+/-）杂合子小鼠表现育不全及颅骨钙化延迟[14]。Ducy等[15]研究发现，在小鼠的胚胎发育期，可见Cbfal mRNA在颅骨、中轴骨及四肢骨MSCs聚集区表达，而这些细胞是均能分化成成骨细胞及成软骨细胞的双能前体细胞，此后，随着胚胎的进一步发育，当MSCs进一步分化时，Cbfal只表达于向成骨细胞定向分化的细胞中，而在已分化了的软骨细胞中已检测不到它。由此可见，在BMSCs向成骨细胞分化中需要Cbfal的参与。本实验检测MOP含药血清在诱导BMSCs骨向分化过程中Cbfa-1基因表达的变化。结果显示，成骨诱导组、巴戟天多糖含药血清组和联合组的Cbfa-1 mRNA表达均有升高空白组，差异有统计学意义，提示MOP含药血清在促BMSCs骨向分化过程中，可以上调Cbfa-1 mRNA的表达。而与成骨诱导组比较，巴戟天多糖含药血清组不及成骨诱导组，差异有统计学意义，提示MOP含药血清的作用强度不及化学诱导剂。

综上所述，本研究证明巴戟天多糖含药血清可以促进BMSCs向成骨分化，这一过程中，上调Cbfa1mRNA的表达可能是其作用机制之一。

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（收稿日期：2017-05-11）