杨厚涞，孙华文，孙科明，王秋爽

武汉大学人民医院胃肠外科，湖北 武汉 430060

M细胞及AIEC经M细胞途径致克罗恩病研究进展

杨厚涞，孙华文，孙科明，王秋爽

武汉大学人民医院胃肠外科，湖北 武汉 430060

M细胞具有特殊的形态结构，其作为肠道一种免疫细胞，也是一种特殊的抗原转运细胞，与肠黏膜免疫功能密切相关。在克罗恩病(Crohn’s disease,CD)早期，存在M细胞增生、破裂这种细胞学水平的病理损伤，本研究就目前国内外学者所做M细胞的起源、形态结构、功能及贴壁侵入性大肠杆菌(adherent-invasive Escherchia coli,AIEC)经M细胞途径致CD研究进展作一概述。

M细胞；起源；形态结构；功能；克罗恩病；侵入性大肠杆菌

消化道黏膜是人体最大的免疫器官。消化道黏膜表面经常受到外来抗原物质侵袭，如病毒、细菌及颗粒物质和寄生虫等。胃肠道抗原物质的行为很大程度上由它们与胃肠道的各种障碍相互作用决定。这些障碍包括胃液pH环境、胃肠道酶降解、黏液屏障和肠上皮屏障。在胃中，酸性环境中能诱导肠内容物氧化或水解。胃肠酶，如蛋白酶、核酸酶和脂肪酶，导致生物分子的降解和消化。因此，肠上皮是调节进入肠腔的物质侵入全身和淋巴循环的物理和生理屏障。肠道黏膜内存在丰富的孤立淋巴小结、弥散淋巴组织及集合淋巴小结，这些共称为肠道相关淋巴组织(GAIT)。肠上皮的保护作用主要由于免疫感应组织的存在，即Peyer氏斑(PP)，可以触发抗原刺激后的免疫反应[1]。这种上皮的特征在于存在微褶皱细胞(Microfold cell，M细胞)，其表面没有致密的微绒毛，取而代之的是丰富的小微褶皱，也有人称之为膜性细胞(membranous cell)。肠道M细胞主要存在于PP上的滤泡相关上皮细胞(follicle-associated epithelium，FAE)、孤立淋巴结、阑尾和胃肠道外的黏膜相关淋巴组织；也是除小肠上皮细胞外，参与肠道免疫的细胞，是一种特殊的抗原运转细胞(包括转运蛋白质、病毒、细菌、颗粒物质和寄生虫等)[2-3]。

1 M细胞的分化起源

目前认为，M细胞起源于小肠微绒毛和派氏结圆顶之间隐窝内的干细胞，该类干细胞具有不确定的分化方向，有两种完全不同的分化、迁移轴，可向微绒毛方向迁移，此类细胞分化成为吸收性肠上皮细胞、肠内分泌细胞和杯状细胞，也可向派氏结圆顶迁移，此类细胞则分化成为FAE细胞和M细胞[4]。目前为止，在体内研究M细胞的功能仍然很困难，由于低M细胞数和对M细胞分化程序缺乏了解，导致缺乏一些实验工具来操纵M细胞在体内的功能[5]。体外研究已经表明，PP的衍生细胞可以在人结肠癌Caco-2细胞诱导出M细胞的特性。功能性M细胞在B细胞缺陷[6]、CD137缺陷[7]和趋化因子CC受体6(CC R6)缺陷的小鼠中均不存在。在CCR6缺陷小鼠，该表型可以通过CCR6+CD11cintB细胞[8]的植入被还原正常，这表明B细胞可以诱导M细胞的表型。最近这个概念被改进，以区别在M细胞发展的两个独立的步骤：(1)M细胞谱系B细胞非依赖性分化;(2)B细胞依赖性分化，其导致功能活性转运M细胞的形成[7]。M细胞的分化程序可以被NF-κB配体(RANKL)的受体活化剂的应用诱导，这种活化剂是非造血间充质细胞表达的肿瘤坏死因子(TNF)超家族成员[9]。通过RANKL途径诱导产生的M细胞已经具备功能M细胞的详细转录组分析，并识别ETs转录因子SpiB，它是驱动M细胞分化程序[10]的一个关键因素。接着，B细胞被认为引发基底气囊的形成，并通过CD137-CD137L相互作用[7]诱导前体M细胞功能性成熟。因此，根据M细胞在不同分化步骤的受损，上皮细胞可能会出现一些特征性的M细胞，但不是功能性抗原提呈细胞。因此，对M细胞分化程序更深入的了解才有可能促进体内M细胞功能的实验调制。

2 M细胞的结构

M细胞摄取转运功能的发挥与其特殊的结构特点密切相关。在肠道中吸收上皮细胞和M细胞(非吸收性的上皮细胞)通过紧密连接(TJs)互连，从而形成一个相对不可渗透的限制外来物质吸收的屏障。但在结构上M细胞与肠上皮细胞有显著区别：其表面的糖被层厚度仅为20 nm，明显低于肠上皮细胞的400 nm。M细胞顶端缺乏刷状缘，有利于与肠腔内容物的接触和黏附；M细胞顶端呈圆顶状，M细胞基底层凹陷形成“口袋样”结构，其顶部及周边胞质很薄，这样缩短了外源物质的跨胞转运距离，该结构中含有丰富的淋巴细胞及少量巨噬细胞、树突状细胞，有利于抗原物质快速进入上皮下淋巴组织，从而诱导黏膜免疫应答，胞质中含有大量的吞饮小泡，M细胞的基底膜常常是不连续的，可允许淋巴细胞自由穿过[11]；与肠道其他细胞不同，M细胞具有降低的蛋白酶活性和较少糖萼，这样可以保持外源物质转胞后的特性较少改变[12]。

3 M细胞的功能

在肠道，已经发现的抗原提呈细胞包括M细胞、巨噬细胞、树突细胞、杯状细胞。M细胞有很强的转胞容量，并能传输多种类型的材料，如细菌、病毒和抗原，从而诱导管腔底层淋巴组织发生免疫应答[13-15]。Rios等[16]研发了一种特殊实验小鼠，这种小鼠肠道上皮Tnfrsf11a有条件地缺失，从而使RANKL依赖的M细胞分化的受体激活剂无效。他们用这种小鼠来研究肠道M细胞在取样抗原从而刺激分泌SIgA作为对肠道细菌的免疫应答中的角色和作用。肠道无M细胞的小鼠，表现出PP中的生发中心(germinal center,GC)成熟明显延迟和固有层的IgA浆细胞的出现显著延迟，导致在成年小鼠粪便的SIgA的水平减弱持续存在。分析RANKL缺失小鼠肠道SIgA的反应，认为在促进GALT对共生菌群的抗原提呈，从而启动SIgA的生产，维持具有丰富定植共生菌群的上皮组织免疫动态平衡等方面，M细胞有举足轻重的作用。纳米粒和细菌可引起M细胞顶膜皱裂和肌动蛋白细胞骨架的重排，继而被细胞吞噬[17]。病毒等则通过网格蛋白包被小泡被M细胞内吞。麦胚凝集素(WGA)则通过受体介导被内吞。M细胞通过吞噬、胞吞、胞饮和跨胞转运等多种机制将肠腔中的外源性大分子物质运送至肠道固有层。在肠道，病原体可以把M细胞作为穿过上皮屏障的门户[18]。

M细胞表面存在一些重要的病原体识别受体(PRRs)，如血小板活化因子受体(PAFR)、Toll受体4(TLR-4)、α5β1-整合素、CD155及小窝蛋白-1[19]等在小鼠和人的M细胞表面都有表达[20]。PRRs与细菌的病原相关分子模式(PAMPs)，如肽聚糖、脂多糖、脂磷壁酸和细菌鞭毛蛋白分子等相互作用，构成消化道内抗原或病原微生物转位的关键。Ma等[21]开发脂质脂球体(PLGA)，且观察到脂质球体显示出比裸的PLGA粒子模型更高的M细胞转胞效率。Fievez等[22]研究表明，基于甘露糖修饰或肽类似物的纳米颗粒显示出比正常精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)的纳米颗粒更有效的胞转和口服接种。Mishra等[23]研究表明，外源凝集素锚定的PLGA纳米微粒经口服抗原传递可能引起强烈的黏膜和全身免疫反应。Yoo等[24]确定了CKSTHPLSC肽(CKS9)，这种肽通过噬菌体吞噬侵染的便利强化壳聚糖纳米粒子的跨M细胞转胞。所述CKS9壳聚糖缀合物还用于装饰多孔PLGA微粒递送猪痢疾疫苗，诱导黏膜和系统免疫应答[25]。

颗粒物质的直径影响M细胞对颗粒物质的转运，当微球粒径<5 μm时，易于PP吸收进入全身淋巴组织循环，导致全身免疫，产生大量IgG；当粒径位于5～10 μm时，经PP吸收后，滞留其中，最终导致SIgA的生成；当微球粒径>10 μm时，被PP吸收得很少[26]。因此，直径为1～10 μm的抗原微球进入肠道后，既可以产生全身免疫反应，也可以在病原容易入侵的黏膜部位产生局部免疫反应。此外，Wang等[27]发现，合成的载入介孔二氧化硅纳米颗粒(BSA)具有130 nm、430 nm和1～2 mm的尺寸，并发现，在430 nm颗粒纳米是最有效的口服免疫及引发全身和黏膜免疫应答。

4 AIEC经M细胞途径致CD的相关研究

研究[28]表明，CD是一种肠道慢性反复发作的自身免疫性疾病。其特征为肠道免疫功能的失调，其确切的发病机制还未完全阐明，目前认为感染、遗传、环境及免疫异常共同参与了CD的发病。浦江等[29]对CD患者和正常对照组进行透射电镜、扫描电镜观察对比发现，CD回肠黏膜圆丘顶部M细胞数量较正常对照组明显增多，可见较多M细胞顶面隆起，淋巴细胞由顶面破裂的M细胞突入肠腔。他认为，肠道病原体、抗原的慢性刺激与机体免疫异常，可能是导致CD患者肠道黏膜淋巴滤泡增生、M细胞显著增多的原因。已经证实，复发性CD的最早病变为PP的糜烂[30]。

细菌参与炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)的发病机理，但机制知之甚少[31]。在CD患者肠道黏膜，贴壁AIEC数量的增加已经在回肠和结肠被发现。此外，研究[32]发现，AIEC持续侵入肠上皮细胞并在其中繁殖，它们通常表达于M细胞转运相关的长极菌毛基因A(lpfA)，因此，M细胞途径更可能是细菌用于体内侵入的主要初始路由。此外，研究[30]报道，在AIEC功能lpf操纵子的存在下，细菌编码长极性菌毛，它允许AIEC细菌与PP相互作用并跨越M细胞易位。Prorok-Hamon等[33]研究发现，结肠黏膜相关afa-1阳性AIEC的数量在CD和结肠癌(CRC)增加。最近一项研究发现，在小肠M细胞顶面表达的糖蛋白-2(GP-2)是表达FimH抗原的细菌如大肠埃希菌、伤寒沙门菌等特异性的转胞吞受体[34]。研究还发现，具有Ⅲ型分泌系统的大肠埃希菌在M细胞中的转运速率也有明显的提高[35]。当大肠埃希菌表达Ⅰ型菌毛时其亚单位FimH能特异性黏附在M细胞的膜蛋白GP2糖基化的甘露糖残基，从而诱导M细胞对大肠埃希菌的转运[36]。研究认为，AIEC分泌各种促血细胞凝集素，侵入上皮细胞系，在巨噬细胞内繁殖，跨越M(微皱)细胞易位和损伤的DNA[33]。

综上所述，M细胞具有其独特的结构和功能，M细胞转运抗原是启动黏膜免疫应答重要的第一步[37]。在M细胞的“口袋”中，淋巴细胞能很快地与进入的抗原发生作用，从而引起一系列的系统免疫调节。M细胞增生、破裂这种细胞学水平的病理损伤在AIEC引起的CD早期发病机制中可能发挥重要作用。综合关于M细胞起源、结构、功能、M细胞在CD早期的病理变化及AIEC经M细胞途径致CD相关研究，可以看出M细胞在AIEC致CD的过程中起关键性作用。M细胞可能作为AIEC入侵肠黏膜的第一门户，当M细胞被破坏后肠上皮屏障被破坏，这是CD多米诺骨牌效应的第一步。接下来抗原对机体的长期反复刺激，肠上皮局部反复的炎症反应，肠上皮细胞、M细胞等反复的增生，反复的被破坏，肠上皮对损伤的纤维修复，这样促成CD的发生、发展。综合所有研究观点，本文推测了AIEC作用于M细胞引起CD的可能机制(见图1)。

图1 AIEC作用于M细胞引起CD的可能机制

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(责任编辑：马 军)

Research progress of M cell and AIEC caused Crohn’s disease by M cell-mediated pathway

YANG Houlai, SUN Huawen, SUN Keming, WANG Qiushuang

Department of Gastrointestinal Surgery, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, China

M cells, with special morphological structure, are a kind of immune cells in the gut, and also a kind of special antigen-transporting cells, and are closely related to the intestinal mucosal immune function. At an early stage of Crohn’s disease (CD), the presence of M cells proliferation and pathological fracture damage of cytology existed. This article will review literatures about M-cell origin, morphological structure, functions, and adherent-invasive Escherchia coli (AIEC) caused CD by M cell-mediated pathway in recent years.

M cell; Origin; Morphological structure; Function; Crohn’s disease; AIEC

国家自然科技基金资助项目(81170368)

杨厚涞，在读研究生，住院医师，研究方向：炎症性肠病。E-mail: 420528a24yg.cdb@sina.cn

孙华文，主任医师，博士，研究方向：炎症性肠病。E-mail： Sunhuawen888@163.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.07.027

R574.62

A

1006-5709(2017)07-0819-04

2016-08-01