特发性卵巢早衰患者AMH，AMHR—Ⅱ基因多态性分析

2017-08-17荆霞许丽华陈碧张维唐棣

中国医药科学 2017年12期

荆霞??许丽华??陈碧??张维??唐棣??王笑??林志梅??王丽莲??邹琳

[摘要] 目的探讨特发性卵巢早衰与AMH，AMHR-Ⅱ的基因多态性。方法选择2015年6月～ 2017年3月在我院诊断的特发性卵巢早衰患者50例为POF组。另选择健康体检者100例为对照组。PCR方法测定两组AMH，AMHR-Ⅱ基因多态性。结果 POF组AMH基因突变位点基因型及等位基因频率与对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。POF组AMHR-Ⅱ c.49+10T>G 基因位点GG基因型比例显著高于对照组，G等位基因频率显著高于对照组，c.622-2C>T基因位点TT基因型比例显著高于对照组，T等位基因频率显著高于对照组，c.622-24C>A 基因位点AA基因型比例显著高于对照组，A等位基因频率显著高于对照组，c.1038G>T基因位点TT基因型比例显著高于对照组，T等位基因频率显著高于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论 AMHR-Ⅱ基因多态性可能是特发性卵巢早衰的重要的发病机制。

[关键词] 特发性卵巢早衰；AMH；AMHR-Ⅱ；基因多态性

[中图分类号] R711.75 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2017）12-07-04

Polymorphism analysis of AMH， AMHR- II gene in patients with idiopathic premature ovarian failure

JING Xia XU Lihua CHEN Bi ZHANG Wei TANG Di WANG Xiao LIN Zhimei WANG Lilian ZOU Lin

Reproductive Medicine Centre， Affiliated Hospital of Guangdong Medical University， Guangdong， Zhanjiang 524001， China

[Abstract] Objective To discuss polymorphism analysis of AMH， AMHR-Ⅱ gene in patients with idiopathic premature ovarian failure. Methods 50 cases with idiopathic premature ovarian failure from Jun 2015 to Mar 2017 were selected as POF group. And 100 cases for physical examination were selected as control group. Polymorphismof AMH， AMHR- II gene of two groups was detected by PCR. Results Genotype and allele frequency of AMH gene mutation sites of POF group showed no significant difference with the control group（P>0.05）. The proportion of GG genotype in AMHR- loci II， c.49+10T>G of POF group was higher than that of the control group， and G allele frequency was higher than that of the control group； The proportion ofTTgenotype inc.622-2C>Tof POF group was higher than that of the control group， and Tallele frequency was higher than that of the control group；The proportion ofAAgenotype inc.622-24C>Aof POF group was higher than that of the control group， and Aallele frequency was higher than that of the control group；The proportion ofTTgenotype inc.1038G>Tof POF group was higher than that of the control group， and Tallele frequency was higher than that of the control group； The difference showed significant difference（P<0.05）. Conclusion Polymorphism of AMHR-Ⅱ gene may be an important pathogenesis of idiopathic premature ovarian failure.

[Key words] Idiopathic premature ovarian failure； AMH； AMHR-Ⅱ； Gene polymorphism

特發性卵巢早衰是指无精确原因的，自身免疫抗体正常的，染色体核型正常的女性在40周岁之前出现的性器官萎缩、持续性闭经，伴有卵泡雌激素、黄体生成素升高，雌激素下降的一种综合征[1-2]。我国卵巢早衰的发病率相对较高，而其中有80%为特发性卵巢早衰，患者主要表现为月经紊乱，血管

舒缩功能不稳定，容易出汗、潮热、情绪波动等。目前特发性卵巢早衰的发病机制还不十分明确，可能与遗传、自身免疫因素、感染、代谢异常、环境等有关[3-4]。特发性卵巢早衰尚无明确有效的治疗方法。抗苗勒激素（AMH）属于转化生长因子超家族成员，与人类生殖系统的发育及功能密切相关[5-6]。其与抗苗勒激素Ⅱ型受体（AMHR-Ⅱ）结合而发挥作用。本研究分析特发性卵巢早衰患者AMH以及AMHR-Ⅱ基因多态性，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2015年6月～2017年3月在我院诊断的特发性卵巢早衰患者50例为POF组。纳入标准：年龄18～39岁，汉族，无月经来潮≥4个月；超声检查显示内生殖器萎缩；两次间隔1个月以上检测空腹血清FSH>40IU/L；排除有明确病因的卵巢早衰。排除标准：既往腮腺炎病史，盆腔结核病史，卵巢手术，盆腔内放疗、化疗者。所有患者对本次研究知情同意，本研究经过医院医学伦理委员会同意。另选择健康体检者100例为对照组。POF组年龄18 ～ 39岁，平均（35.1±7.5）岁。对照组年龄21～39岁，平均（35.5±7.1）岁。两组平均年龄比较差异无统计学意义（P>0.05）。

1.2 方法

POF组患者与对照组均于月经来潮第三天采集晨起空腹静脉血10mL用于检测，POF组中无月经来潮的患者，B超观察双侧卵巢无优势卵泡形成时采集晨起空腹静脉血标本。-75℃保存待测。血标本提取DNA：采用饱和酚/氯仿法提取目的基因DNA片段；血标本解冻，取2mL置于离心管中，加10mL灭菌蒸馏水，颠倒混匀，静止10min；4000转/min离心10分钟，弃上清，重复离心3次，至上清液澄清；沉淀物种加STE700μL，SDS 1～2滴，蛋白裂解酶K 10μL，摇匀，37℃温浴过夜，至沉淀完全消失，室温下离心，弃上清，将细胞沉淀转至1.5mL试管；试管内加入饱和酚至试管加满，摇匀，静置5min，16000转/min离心10分钟，提取上清液至另一个1.5mL试管，加等体积氯仿，摇匀，静置5min，16000转/min离心10min，取上清，加入1.5mL试管，加入95%冰冻酒精，醋酸钠1滴，摇匀；16000转/min离心10min，弃上清，75%冰冻酒精萃洗沉淀，16000转/min离心5min，弃上清，自然干燥，得DNA。AMH、AMHR-Ⅱ基因检测：自数据库中获得AMH、AMHR-Ⅱ基因相关序列，采用引物设计软件设计正向及反向引物。配制引物。PCR反应体系：模板DNA 1μL，正向引物 1μL，反向引物1μL，MgCl2 3μL，10×Buffer 3μL，dNTPs 3μL，Tag酶 0.3μL，H2O 17.7μL。PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。PCR扩增产物进行纯化及序列测定。

1.3 统计学处理

采用SPSS17.0统计学软件对数据进行分析，计数资料采用χ2检验，计量资料以（）表示，采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组AMH基因突变位点基因型及等位基因频率比较

见表1。POF组AMH基因突变位点基因型及等位基因频率与对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。

2.2 两组AMHR-Ⅱ基因位点基因型及等位基因频率比较

见表2。POF组AMHR-Ⅱ c.49+10T>G 基因位点GG基因型比例显著高于对照组，G等位基因频率显著高于对照组，c.622-2C>T基因位点

TT基因型比例显著高于对照组，T等位基因频率显著高于对照组，c.622-24C>A 基因位点AA基因型比例显著高于对照组，A等位基因频率显著高于对照组，c.1038G>T基因位点TT基因型比例显著高于对照组，T等位基因频率显著高于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。

3 讨论

卵巢早衰是指卵巢功能衰竭所导致的40岁之前即闭经的现象。其特点是原发或继发闭经伴随血促性腺激素水平升高和雌激素水平降低，并伴有不同程度的一系列低雌激素症状，如潮热多汗、面部潮红、性欲低下等。卵巢早衰是一种异质性疾病，与自身免疫、遗传因素、代谢异常、感染、环境等有关。卵巢早衰是一种有多种病因的综合征，在大部分的病例中病因还不明确。患者表现为闭经、不孕、低雌激素症状、伴发的自身免疫性疾病等。特发性卵巢早衰最常见，患者原因不明，患者可无明确的诱因，自身免疫抗体正常，染色体核型正常。特发性卵巢早衰患者大部分染色体核型分析正常，提示遗传性治病因素可能发生在单基因或者核苷酸分子水平。随着分子生物学计数的发展，越来越多的特发性POF易感基因被发现[7-8]。

特发性POF患者表现为先天性卵子数量减少，正常卵泡闭锁过程加速，或者出生后卵子被不同机制破坏导致卵泡过早耗竭。卵泡发生及发育受下丘脑-垂体-卵巢轴调控，也与卵泡刺激素有关，还受到卵巢内自分泌、旁分泌的影响。近年来卵巢局部的微调节在卵泡生长发育过程中的作用逐渐受到关注。卵巢内合成局部调节因子有转化生长因子超家族、胰岛素生长因子系统，颗粒细胞、卵泡膜细胞来源的抑制素、激活素等。抗苗勒管激素（AMH）属于转化生长因子超家族成员，与生殖系统发育及功能有密切的相关性，在女性生殖功能活动中发挥重要的作用。AMH异常可导致内在卵泡生长发育异常，卵巢颗粒细胞分泌异常[9-10]。AMH抑制始基卵泡。AMH由两个相同的70kb亚基通过二硫键链接组成，属于二聚糖蛋白，相对分子量140×103，人类AMH编码基因位于19号染色体短臂。女性AMH主要由卵巢颗粒细胞分泌。AMH抑制始基卵泡的启动，抑制窦卵泡对FSH的敏感性，抑制卵泡的发育及成熟[11-12]。AMH是评估卵巢储备功能的客观准确的指标，能够更敏感更准确地反应年龄相关卵巢储备功能下降；其不受月经周期的影响，具有较强的稳定性；AMH不受激素避孕药的影响，便于临床使用[13-14]。卵巢的储备功能取决于卵巢内库存卵泡数量与质量，随着年龄增长，卵巢内存留的可募捐卵泡数目减少以及卵子质量下降可导致生育能力下降，卵巢储备功能降低[15]。评估卵巢储备功能对预测生育潜能与卵巢功能状态具有重要的临床意义。在众多的卵巢储备功能评估指標中，AMH是最早随着年龄增长发生改变的指标，可敏感地评估年龄相关的生育能力下降。AMH受体分为Ⅰ型与Ⅱ型两种，表达在苗勒氏管周围间质细胞、两性性腺。研究证实AMHR-Ⅱ型与AMH具有高度的亲和力，AMH与其结合后，发挥相应的作用。

单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP），主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种。本研究中分析POF患者与健康对照组AMH以及AMHR-Ⅱ单核苷酸多态性，分析与POF的相关性。分析结果显示，POF患者与健康对照组AMH单核苷酸多态性在c.146T>G、c.303G>A、c.546G>A基因型及等位基因频率并没有显著地差异。而AMHR-Ⅱ单核苷酸多态性在c.49+10T>G 、c.622-2C>T、c.622-24C>A、c.1038G>T 基因型及等位基因频率存在显著差异。这个结果提示，在POF的发病机制中，AMH基因多态性可能并未参与，而AMHR-Ⅱ基因多态性与POF的发病具有密切的关系，可能是直接或者间接导致特发性POF的相关位点。

综上所述， AMHR-Ⅱ基因多态性可能是特发性卵巢早衰的重要的发病机制之一。

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