陈成+王宏喜+康虹健+姚要+卿光焱+李秀玲+梁鑫淼

摘 要 本研究采用原子转移自由聚合（Atom-transfer radical-polymerization， ATRP）法合成了一种新型四肽亲水作用色谱材料 （Poly-DAPD），用于糖肽的选择性富集。通过氮气吸脱附、热重分析和X射线光电子能谱等技术进行表征，结果表明，四肽已成功接枝到硅球上。固相萃取富集实验表明，合成的亲水材料对牛胎球蛋白（Fetuin）糖肽富集选择性高； 与商品化ZIC-HILIC材料相比，Poly-DAPD材料富集掺有5摩尔倍数牛血清蛋白（BSA）的Fetuin样品时，在获得的糖肽数目及抗干扰性能方面都更具优势。此Poly-DAPD材料可进一步用于不同糖蛋白的糖基化分析研究。

关键词 亲水作用色谱； 四肽； 糖肽富集； 质谱

1 引 言

蛋白质糖基化是糖链通过共价键结合到蛋白上[1]。 糖蛋白参与许多重要的生命进程，如免疫应答、信息传递、细胞迁移等[2]。糖蛋白上糖链的改变会导致其所修饰的蛋白质结构和功能发生变化，甚至会导致疾病[3]。蛋白质的糖基化分析对其生物学功能及阐明相关疾病的致病机理具有重要意义。

蛋白质的糖基化分析通常通过质谱（Mass spectrometry， MS）分析实现[4]。虽然生物质谱的进步推动了蛋白质组学的发展，但由于复杂样品中糖肽浓度低，以及质谱分析中非糖肽对糖肽的离子抑制作用， 蛋白质的糖基化分析仍具有挑战性。因此，发展合适的糖肽富集方法具有重要意义。

近年来，科研工作者发展了一些糖肽富集方法，主要包括肼化学反应法[5]、硼酸化学反应法[6]、凝集素亲和法[7]和亲水作用色谱（Hydrophilic interaction liquid chromatography， HILIC）[8]等。每种方法在糖肽富集方面都有其自身的優缺点，如凝集素色谱法对糖肽的专一性高，但是只对含有某一类末端糖的糖肽有效。在这些方法中，HILIC因其对糖基化覆盖率高，方法重现性好，易于与MS联用等优点[9]而备受关注。用于糖肽富集的HILIC材料主要包括酰胺基[10]糖基[11]、氨基酸、二肽等[12]。含有不同官能团的HILIC材料对糖肽富集的效果也不同，因此，发展新型亲水材料将有助于进一步提高糖肽富集的效率。

凝集素亲和色谱法是利用肽-糖之间的相互作用通过多重氢键和特定的空间实现凝集素对糖蛋白/糖肽的特异性富集[7]。本研究将四肽引入到聚合物中，拟通过四肽与糖肽间的多重氢键作用和电荷可调控性，实现糖肽的选择性富集。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

LC-20AT液相色谱仪（日本岛津有限公司）； CS136XT多肽合成仪 （美国希施生物仪器有限公司）； QuadraSorb SI4物理吸附仪（美国康塔仪器公司）； STA 449 F3同步热分析仪（德国耐驰公司）； ESCALAB 250 Xi光电子能谱仪（美国赛默飞世尔科技有限公司）； MicroTOF-Q液相色谱-质谱联用仪（德国布鲁克集团）； nanoESI Q-TOF MS液相色谱-质谱联用仪（美国Waters 公司）； Milli-Q超纯水仪（美国默克密理博公司）。

实验中所用的溶剂、化学样品均购于Merck公司。所有溶液均采用Milli-Q 超纯水配制。GELoader 吸头小柱（德国 Eppendorf公司）； 300硅球、C18HC材料（浙江华谱新创科技有限公司）； ZIC-HILIC材料（美国BioChem公司）； DAPD由上海杰肽公司合成。

2.2 实验方法

2.2.1 Poly-DAPD材料的合成 四肽材料的合成采用原子转移自由聚合ATRP法进行接枝共聚[13]，反应流程见图1。首先取2 mmol高纯度DAPD放入圆底烧瓶，加入15 mL无水N，N-二甲基甲酰胺（DMF），在0℃冰浴搅拌，加入三乙胺稳定10 min，再使用恒压漏斗滴加同三乙胺体积的丙烯酰氯，反应30 min，移至常温搅拌再反应24 h，减压蒸馏去除溶剂，甲醇再溶解后去除溶剂，重复3次，低温保存备用。将1 g 300 硅球混入HCl，常温搅拌48 h，水洗过滤，直到滤液呈中性，真空干燥。称取干燥后的羟基化硅球1 g，加入无水甲苯，冰浴搅拌并通入N2，滴加10%3-氨丙基三甲氧基硅烷常温反应12 h，反应完成后用无水乙醇冲洗，真空干燥。取氨基化的硅球1 g，加入15 mL无水DMF，在0 ℃冰浴搅拌，稳定后加入0.3 mL吡啶， 通入N2， 滴加溴代异丁酰溴，避光常温反应12 h。所得产物用DCM多次清洗，真空干燥后密封保存。将0.8 g 酰氯化 DAPD（溶于3 mL纯水）和1 g酰溴化的硅球（混于4 mL纯水）移至茄型瓶中，超声混匀后在常温下密封，液氮冻融循环，并用油泵抽干空气。快速加入CuBr后，通入N2，再加入160 μL N，N，N'，N'，N''-五甲基二亚乙基三胺（PMDETA），等反应液变成墨绿色后避光油浴加热，60℃下反应6 h。过滤并转移至锥形瓶， 加入50% 甲醇-水溶液50 mL，加热冷凝回流24 h， 过滤干燥。合成后的材料通过TGA、XPS、氮气吸脱附等技术进行表征或分析。

2.2.2 胎球蛋白和BSA蛋白酶解 分别将1 mg胎球蛋白（Fetuin）和牛血清蛋白（BSA）标准品加入100 μL 6 mol/L 尿素，充分溶解后加入5 μL 200 mmol/L 二硫苏糖醇，在56℃下振荡45 min，然后加入20 μL 200 mmol/L 碘代乙酸铵， 避光常温放置30 min。用50 mmol/L NH4HCO3溶液稀释10倍，加入胰蛋白酶25 μg， 在37℃反应过夜，最后加入5 μL甲酸终止反应。所得的酶解液浓度约为1 mg/mL。上述溶液均溶于50 mmol/L NH4HCO3水溶液。

2.2.3 蛋白标准品酶解液脱盐 称取1 mg C18HC 材料加20 μL乙腈混匀，均匀加压装填入塞有单层 3M C18膜片的GELoader小柱。所得的固相萃取 （SPE） 小柱首先用20 μL 50% ACN/0.1% FA 溶液冲洗活化，再加入20 μL 0.1% FA 溶液平衡，然后将要去盐的酶解液上样。上样后用40 μL 0.1% FA 溶液淋洗、20 μL 50% ACN/0.1% FA 溶液洗脱。洗脱液进行质谱分析。

2.2.4 Poly-DAPD材料和 ZIC-HILIC材料富集糖肽 称取1 mg Poly-DAPD材料，按2.2.3节的方法装填成SPE小柱。将5 μL Fetuin酶解液溶于20 μL 80% ACN/0.1% FA后上样，再用20 μL 75% ACN/0.1% FA淋洗两次，最终用20 μL 40% ACN/0.1% FA洗脱。洗脱液进行质谱分析。ZIC-HILIC材料富集糖肽的实验参照文献[14]进行。

2.2.5 质谱分析 Nano ESI Q-TOF MS进样流速为1 μL/min； 正离子模式下， nanospray 电压为2.5 kV； 扫描范围为m/z 600～2000。通过整理文献报道的糖型和胰蛋白酶酶解后的肽链等信息并做成理论糖肽表格[8]，手动核对m/z值及电荷数（±0.3 Da），电荷数必须一致，部分糖肽由二级质谱确认。

3 结果和讨论

3.1 Poly-DAPD材料的合成及表征

采用ATRP方法合成了Poly-DAPD，具体合成路线见图1。合成后的材料通过TGA、XPS、氮气吸脱附等温仪等进行表征。氮气吸脱附等温线表明，硅球样品呈标准的III型等温线，而不是Ⅱ型等温线，曲线没有拐点，说明硅球上接枝有聚合物（图2A）； 从图2B可见，接枝后聚合后孔隙率变小，硅球的孔径从38 nm变成32 nm（BJH模型），说明接枝到硅球孔中的四肽厚度为3 nm； 热重分析结果表明，DAPD 接枝到硅球表面的质量为材料质量的5.7%（图3B）。 XPS谱图显示所合成聚合物上含有N、C、O等元素，进一步说明材料合成成功，（图3A）。综上所述，四肽已经成功地聚合到硅球上。

3.2 Poly-DAPD材料富集糖肽及其与ZIC-HILIC材料结果对比

Fetuin是实验室最常见的一种糖蛋白，因其糖基化位点明确，肽段序列清晰，糖肽数目相对丰富[15，16]，常被用于评价合成材料的富集效果。首先将合成的Poly-DAPD材料装在Eppendorf 凝胶吸头中，做成SPE微柱。本实验用Fetuin酶解液在微型SPE模式下评价了Poly-DAPD材料对糖肽富集的选择性。图4A为Fetuin酶解液去盐液的质谱分析谱图，未经过富集的Fetuin酶解液质谱图中大部分信号都是高丰度的非糖肽，糖肽只有两条，分别是1470.2671（4+）和1634.1296（4+）。图4B是Poly-DAPD材料富集Fetuin中糖肽后的质谱检测谱图。对比富集前，富集后样品中非糖肽数量从18条减少至6条，且剩下的非糖肽信号丰度均较低； 糖肽数量从2条增加至 39 条。新材料处理后的样品中能检测出较多的糖肽，证明新材料对糖肽富集有一定的选择性。

为了进一步考察Poly-DAPD材料对糖肽富集选择性， 采用更加复杂的样品评价，并与广泛用于糖肽富集的商品化材料ZIC-HILIC材料进行了对比。采用Poly-DAPD材料富集掺比有5摩尔倍数的BSA酶解液和Fetuin酶解液的混合物，在优化后的富集条件下可检测到35条Fetuin糖肽（图5A）。同倍数掺比BSA， ZIC-HILIC材料则富集到14条Fetuin糖肽，如图5B所示。两种材料都富集到糖肽但有所不同，如糖肽1316.1968（3+）在Poly-DAPD材料处理后并未检测到，说明新材料的选择性与ZIC-HILIC有所不同。进一步对比富集到的共有糖肽的相对丰度，ZIC-HILIC材料富集的糖肽丰度是Poly-DAPD材料结果（以下丰度对比均以ZIC-HILIC材料富集到最高丰度糖肽1634.1296（4+）为例，在Poly-DAPD材料结果中该糖肽丰度排行第二）的4倍。但ZIC-HILIC材料富集结果中最高非糖肽（1057.4550（2+））豐度是糖肽丰度的6倍，而Poly-DAPD材料富集的最高非糖肽丰度（1006.5145（3+））是糖肽丰度的1倍。结果表明，Poly-DAPD材料比ZIC-HILIC材料富集到的糖肽数目多21条，其富集结果受非糖肽的影响也更小。Poly-DAPD材料作为一种新的亲水材料，对Fetuin 糖肽选择性优于ZIC-HILIC材料， 并具有一定的抗干扰能力， 证明此材料在实际样品糖基化研究当中的潜力。

4 结 论

合成了一种基于四肽的新型 HILIC材料，并对其结构和形貌进行了表征。Poly-DAPD对糖肽的富集选择性显著高于商品化ZIC-HILIC材料， 表明此新型HILIC材料用于糖肽富集中具有较好的应用前景。

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