梁云霄，孙建安，高昕，毛相朝

(中国海洋大学食品科学与工程学院，山东 青岛 266003)



米曲霉低盐固态发酵虾味酱油的工艺优化

梁云霄，孙建安*，高昕，毛相朝

(中国海洋大学食品科学与工程学院，山东 青岛 266003)

为充分利用水产品资源，丰富食用酱油种类，本研究采用价格低廉、营养物质丰富、来源广泛的脱脂南极磷虾粉和传统的脱脂豆粕、麸皮为原料发酵生产虾味酱油。采用单因素分析方法探讨虾粉用量、润水量以及制曲时间对成曲质量的影响；同时，比较分析优化条件下制得的虾味酱油和普通酱油的品质。结果表明，脱脂南极磷虾粉用量添加量30%，润水量100%，制曲时间48 h时，成曲质量达到最优。感官评定和风味物质分析表明，使用南极磷虾发酵的酱油品质优于普通酱油。有机酸(柠檬酸和苹果酸)含量明显高于普通酱油；氨基酸总量也高于普通酱油，且含有人体所必需的8种必需氨基酸(占总量的44.6%)。上述结果说明，在脱脂豆粕、麸皮原料中添加适量南极磷虾粉，发酵生产虾味酱油，能够显著改善产品品质。本研究有助于推动南极磷虾的高值化利用，同时可为功能性调味品的生产提供技术支持。[中国渔业质量与标准, 2017,7(4):21-28]

酱油；米曲霉；南极磷虾；固态发酵；高值化应用；制曲；工艺优化

南极磷虾(Euphausiasuperba)不但资源巨大，而且营养价值高，磷虾肉的粗蛋白质含量为16.31%[1]，与大黄鱼、带鱼相当。磷虾体内还含有大量的维生素A、D和B，以及相当丰富的矿物质，尤其是镁、钙、磷，它们的含量均满足美国农业部推荐的人类各个年龄阶段每日膳食营养素供给量[2]。南极磷虾是目前人类所发现的生物中蛋白质含量最高的一种水产品，对它的进一步开发利用，将会对人类的食物供应做出巨大的贡献[3]。南极磷虾中的抗氧化性肽有较强的清除自由基能力，其内的蛋白酶也具有加速伤口愈合的作用[4]。目前提取南极磷虾中不饱和脂肪酸的工艺也比较成熟，已用于南极磷虾虾油保健品的生产[5]。但是南极磷虾粉的应用还十分有限，当前主要用于制作饲料，这不仅造成了巨大的资源浪费，而且还易于在制作过程中引发环境污染。

中国酱油产量居世界首位，但主要是以普通酱油为主，一般以豆粕、麸皮等原料发酵而成，口味和营养比较局限。而以鱼、虾、扇贝类等的下脚料发酵生产出的海鲜酱油，因其富含多种营养成分和大量有益人体健康的活性物质，以及其具有浓郁的海鲜风味，深受消费者喜爱，并且在国际市场的需求也呈现快速增长的趋势[6]。因此，传统原料辅以南极磷虾生产功能性酱油，不仅可以实现南极磷虾的高值化利用，还能够为功能性调味品的生产提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料、试剂与仪器

米曲霉(Aspergillusoryzae)由青岛灯塔酿造有限公司提供。葡萄糖、氯化钠、干酪素、甲醛溶液、酚酞、福林酚等试剂均为分析纯；脱脂豆粕、麸皮购自青岛市农贸市场，脱脂南极磷虾粉购自日本水产有限公司(Japan Fisheries Co., Ltd)。实验中所需仪器设备如表1所示。

1.2 低盐固态发酵虾味酱油的生产工艺

低盐固态发酵虾味酱油的生产工艺流程主要分四部分：种曲制备、制曲、发酵、提取(图1)[7]。

1.3 制曲条件优化

1.3.1 脱脂南极磷虾粉的添加量对制曲的影响

在豆粕和麸皮的比例为4∶1(m/m)，润水量100%、蒸料时间30 min、制曲时间72 h的条件下，考察了脱脂南极磷虾粉的用量对制曲的影响。设置的梯度为30%、40%、50%、60%，80%、100%，制曲结束后观察成曲的感官质量，并检测成曲的蛋白酶活力、氨基态氮含量、还原糖含量，所有实验均重复3次，结果以平均值±标准差表示。

表1 实验所用仪器Tab.1 The main instruments used in this study

1.3.2 润水量对制曲的影响

在豆粕和麸皮的比例为4∶1(m/m)，脱脂南极磷粉30%、蒸料时间30 min、制曲时间72 h的条件下，考察了润水量对制曲的影响。设置的梯度为40%、80%、100%、120%、140%，制曲结束后观察成曲的感官质量，并检测成曲的蛋白酶活力、氨基态氮含量、还原糖含量，所有实验均重复3次，结果以平均值±标准差表示。

1.3.3 制曲时间对制曲的影响

在豆粕和麸皮的比例为4∶1(m/m)，脱脂南极磷粉 30%、蒸料时间30 min、润水量100%的条件下，考察了制曲时间对制曲的影响。设置的梯度为24、41、48、60、74 和89 h，制曲结束后观察成曲的感官质量，并检测成曲的蛋白酶活力、氨基态氮含量、还原糖含量，所有实验均重复3次，结果以平均值±标准差表示。

1.4 成曲蛋白酶活力测定

根据须凤高[8]制定的方法进行蛋白酶活力测定，并进行适当改进。准确称取成曲1 g，用pH 7.2磷酸缓冲溶液定容至50 mL，置入40 ℃水浴浸取0.5 h，用纱布过滤。再用pH 7.2磷酸缓冲液稀释一定的倍数。所得液体保存在4 ℃冰箱中待测。在试管内加入样品稀释液1 mL，置于40 ℃水浴中预热2 min，再加入经同样预热的酪蛋白1 mL(对照先加2 mL三氯乙酸将酶灭活后，再加1 mL酪蛋白)，精确保温10 min，再各加入0.4 mol/L三氯乙酸2 mL，以终止反应，继续水浴保温20 min，使残余蛋白质沉淀后离心。取滤液1 mL，加0.4 mol/L碳酸钠5 mL和已稀释的福林试剂1 mL，摇匀，40 ℃保温发色20 min，于660 nm测定吸光值。分别取1 mL 0、20、40、60、80、100 μg/mL酪氨酸制作标准曲线。酶活力定义为：在40 ℃下每分钟水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸，定义为1个蛋白酶活力单位。

图1 低盐固态发酵虾味酱油的生产工艺流程Fig.1 The flow diagram of the Antarctic krill sauce by adopting low-salt solid-state fermentation technology

1.5 氨基态氮含量的测定

酱油的氨基态氮含量采用甲醛滴定法，按照相应的国家标准[9]进行测定。

1.6 还原糖含量的测定

酱油还原糖含量的测定采用DNS法[10]。取样品液0.5 mL(以蒸馏水做空白对照)，加入1.5 mL DNS，在沸水浴中煮沸5 min，流水冲冷却后再分别向各试管中加入蒸馏水4 mL，混匀，540 nm下测定吸光值。使用葡萄糖作为标准品配制一系列梯度浓度的标准溶液，其他同上，绘制吸光度-葡萄糖标准曲线。

1.7 感官评定

以QDA感官评定法进行发酵液的品质评定[11-12]。邀请6名青岛灯塔酿造公司的专业感官评价人士进行评定。设立详细的QDA线性标尺，标尺为两端用词汇固定的线段(10 cm)，最左端代表“0”，中间代表“5”，最右端代表“10”，设置3个参考点(对于较难定标尺的描述语，以具体某一相同特征的市售产品为参考，评价小组讨论并设定参考点)。取20 mL样品倒入50 mL玻璃杯中，使用随机数字给样品编号，每位评价员直接在线性标尺上标记，最后用刻度尺量出起点至标记处的线段长度即为打分值，取平均值作为最终分数[13]。

1.8 游离氨基酸含量的测定

根据张峻松等[14]的方法测定游离氨基酸的含量。其中，色谱柱为阳离子分离柱 Cation Separation Column LCA K07/Li Peek柱 4.6×150 mm。流动相：A为柠檬酸锂(pH 2.9)，B为柠檬酸锂(pH 4.2)，C为柠檬酸锂(pH 8.0)，D为异丙醇-超纯水(30∶70，V/V)，洗脱程序详见表2。流速：洗脱泵0.45 mL/min，衍生泵0.25 mL/min；检测器为集成双波长光度计570 nm+440 nm；温度为38～74 ℃梯度升温(表3)；反应器温度为130 ℃；进样量为50 μL。

表2 氨基酸分析洗脱程序Tab.2 The elution program of amino acid analysis

注：A为柠檬酸锂(pH 2.9)；B为柠檬酸锂(pH 4.2)；C为柠檬酸锂(pH 8.0)；D为异丙醇-超纯水(30∶70，V/V)。

表3 梯度程序设定Tab.3 The temperature gradient of column

1.9 有机酸含量的测定

有机酸含量的分析测定采用高效液液相色谱法[15-16]。主要对样品中的8种有机酸(焦谷氨酸、甲酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸、丙酸)进行测定。应用高效液相色谱仪(Waters 2998)进行测定，色谱柱为Bio-Rad HPX-87H；检测波长为205 nm；柱温为30 ℃；流动相为5 mmol/mL稀硫酸；流速为0.5 mL/min；进样量为10 μL。

1.10 数据处理与统计分析

本数据表示为平均值±标准差(SD)的形式。采用SPSS 19.0(SPSS Inc.，Chicago，IL)进行数据的分析处理，利用Duncan检验分析各组数据间的显著性差异(α=0.05)。

2 结果与分析

2.1 脱脂南极磷虾粉用量对制曲的影响

由表4可知，脱脂虾粉用量30%时，蛋白质活力与氨基态氮含量最高。蛋白质活力与氨基态氮含量随着脱脂虾粉用量的增加呈下降趋势，且蛋白酶活力与氨基态氮含量呈现同步性下降。推测原因是主料之一脱脂豆粕所含的蛋白质是米曲霉生长繁殖所必须的，脱脂虾粉的蛋白质不能很好地被米曲霉充分利用，随着脱脂虾粉用量的增加，脱脂豆粕用量的减少，米曲霉生长缓慢，蛋白酶活力也随之下降，氨基态氮含量也呈现相同的下降。脱脂虾粉用量在50%～60%时，还原糖含量较高，超过60%时有所下降，但到100%又达到最大。这可能是由于米曲霉在曲中总的蛋白酶活不高，但淀粉酶活性可能最强，由此能较好地将原料中的淀粉分解为还原糖。

表4 脱脂虾粉添加量对成曲各质量指标的影响Tab.4 The effect of the amount of shrimp meal on items of quality indexes in finished koji n=3

注：同列数据后标注相同小写字母者表示差异不显著(P> 0.05)。下同。

2.2 润水量对制曲的影响

表5结果显示，随着润水量的增加，孢子生长逐渐活跃，蛋白酶活力也逐渐增大，达到100%时，孢子生长情况进入最佳态，且曲味浓郁，蛋白酶活力达到最大，氨基态氮与还原糖含量也达到最大值。虽然润水量80%与100%时，氨基态氮含量与还原糖含量均无显著性差异，但孢子生长状态尚不完全成熟，曲味也未达到浓郁的曲香程度。其后，随着润水量的增加，出现了转折，蛋白酶活力急剧降低，同时杂菌增多，不仅消耗了原料中大量的淀粉，部分蛋白质也被分解成氨，由此降低了成曲的质量。所以高润水量会对米曲霉的生长起到抑制作用，不仅成本增加，还易导致制曲失败。

2.3 制曲时间对制曲的影响

从表6可以看出，制曲时间24 h时，孢子处于生长初期。随着制曲时间的延长，蛋白酶活力增长较快，氨基态氮含量和还原糖含量均在增加，在48 h时均达到最大值，而后蛋白酶活力值开始缓慢下降。这可能是与米曲霉孢子经过生长、成熟的阶段进入生长后期有关，活力下降也导致了相应氨基态氮含量和还原糖含量也开始下降。

综上分析可知，脱脂南极磷虾粉用量30%、润水量100%、制曲时间48 h时，蛋白酶活力和氨基态氮含量达到最优水平，且还原糖含量也在较高水平。

表5 润水量对成曲各质量指标的影响Tab.5 The effect of the moisture content on items of quality indexes in finished koji n=3

表6 制曲时间对成曲各质量指标的影响Tab.6 The effect of the time of making koji on items of quality indexes in finished koji n=3

2.4 感官评定结果

从外观、滋味、香气、口感和后感5个方面对两种酱油进行感官评定。如图2所示，南极磷虾酱油色泽为浅红褐色，虽然不如普通酱油的颜色深，但南极磷虾酱油光泽度好，澄清透明不浑浊、不分层，挂杯性良好；南极磷虾酱油口感良好，鲜味十足，咸甜适中，南极磷虾特有的虾香味比较浓，而普通酱油不具备该特点。另外，南极磷虾酱油的黏稠度较高，且后味十足，余味和余香均持久。

2.5 有机酸含量的测定

8种有机酸标准混合样品使用高效液相色谱法，经外标定量法计算得各样品中有机酸的含量。南极磷虾酱油和普通酱油中都含有柠檬酸、苹果酸、丁二酸、乙酸和焦谷氨酸(表7)。而南极磷虾酱油中总酸含量比普通酱油高出1.6倍。其中苹果酸有较强的呈味作用，其酸味柔和别致，爽口[17]。两种酱油样品中含有苹果酸，但在南极磷虾酱油中，苹果酸的含量明显提高。柠檬酸具有酸味强，味道柔和爽快，入口即达到最高酸感及酸味持久时间短等特点，与苹果酸共同作用于食品，可以使产品味道浑厚[18]。南极磷虾酱油中柠檬酸含量比普通酱油高12倍之多。由感官评价结果可知，原料中添加南极磷虾的酱油整体风味较好。

图2 南极磷虾酱油定量描述分析法感官评定结果Fig.2 Quantitative descriptive analysis(QDA)of Antarctic krill sauce

表7 普通酱油和虾酱油中的有机酸组成及含量

Tab.7 The component and contents of organic acid in common and shrimp sauces mg·(100 mL)-1

2.6 游离氨基酸分析

为进一步了解其营养结构，又对其氨基酸组成成分及含量进行了初步测定，结果如表8所示。在原料中添加南极磷虾的酱油氨基酸总量略高于普通酱油，含有人体所必需的8种必需氨基酸，且必需氨基酸的总量是总氨基酸的44.6%。

FAO/WHO联合专家委员会推荐的良好蛋白模式为必需氨基酸与非必需氨基酸含量的比例要高于0.6，从表8可以计算出，南极磷虾海鲜酱油中必需氨基酸和非必需氨基酸的比例为0.8，氨基酸组成符合FAO/WHO推荐的理想蛋白模式。且Glu、Thr等鲜甜味氨基酸含量明显高于普通酱油，而Tyr、Leu、His等苦味氨基酸明显低于普通酱油，这大大提高了酱油的鲜味。

表8 普通酱油和虾酱油中的游离氨基酸含量Tab.8 Free amino acid composition of common and shrimp sauces mg·(100 mL)-1

注：Met，甲硫氨酸；Lys，赖氨酸；Val，缬氨酸；Ile，异亮氨酸；Phe，苯丙氨酸；Leu，亮氨酸；Trp，色氨酸；Thr，苏氨酸；Asp，天冬氨酸；Glu，谷氨酸；Ser，丝氨酸；Ala，丙氨酸；Gly，甘氨酸；Tyr，酪氨酸；Arg，精氨酸；Pro，脯氨酸；His，组氨酸；Cys，半胱氨酸。

3 结论

脱脂南极磷虾粉用量为30%，润水量100%，制曲时间48 h时，成曲质量达到最优水平，米曲霉黄绿色菌丝密布，曲香浓厚；测得的蛋白酶活力和氨基态氮含量最高，还原糖含量也达到最优水平。此外，本研究还比较了添加南极磷虾粉发酵的酱油和普通酱油的品质。结果表明：在感官评价方面，南极磷虾酱油不仅具有独特的虾香味，而且鲜味十足、黏稠度高、余味余香持久；有机酸和氨基酸组成分分析也证实了这一点，主要表现在南极磷虾发酵酱油的柠檬酸与苹果酸含量均明显高于普通酱油；氨基酸总量高于普通酱油，尤其是必须氨基酸含量。南极磷虾粉发酵酱油不仅充分利用了南极磷虾粉，也为功能性调味品的开发提供参考。

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Technical optimization of shrimp soy sauce through low salt solidstate fermentation byAspergillusoryzae

LIANG Yunxiao, SUN Jianan*, GAO Xin, MAO Xiangzhao

(College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

To fully utilize aquatic products resource and enrich varieties of edible soy sauce, this study mainly describes the production process of shrimp sauce which uses the defatted Antarctic krill powder, the traditional defatted soybean meal and the wheat bean as raw materials. The single-factor analysis was used to discuss the effects of the amount of shrimp meal, moisture content and the time of making koji on the quality of the pastiche. The flavor and physicochemical indexes of shrimp sauce were also analyzed compared to common sauce, which lay the foundation for the next fermentation process optimization. The results showed that the quality index of finished koji reached to the optimal when the amount of defatted Antarctic krill powder was 30%, the moisture content was 100%, and the time of making koji was 48 h. The sensory evaluation showed the defatted Antarctic krill powder, which was one of the raw materials, could adjust the flavor of soy sauce well. The contents of citric acid and malic acid in Antarctic krill sauce were obviously higher than that in common sauce; and the total content of amino acids was also at a higher level in the Antarctic krill sauce, which contained 8 essential amino acids (44.6% of the total). These results demonstrated that the defatted Antarctic krill that added to the defatted soybean meal and wheat bean as raw materials could significantly improve the flavor in the fermentation production of soy sauce. The research should contribute to the high-value utilization of the Antarctic krill and provide technical support for the functional condiments production. [Chinese Fishery Quality and Standards, 2017, 7(4):21-28]

soy sauce;Aspergillusoryzae; antarctic krill; solid state fermentation; high-value untilization; koji-making; optimization

SUN Jianan, sunjianan@ouc.edu.cn

10.3969/j.issn.2095-1833.2017.04.004

2017-04-06；接收日期：2017-05-15

山东省重点研发计划项目(2016YYSP016)

梁云霄(1990-)，男，硕士研究生，研究方向为海洋生化工程，liangyunxiao1990@163.com 通信作者：孙建安，副教授，研究方向为食品生物技术与海洋生化工程，sunjianan@ouc.edu.cn

S98

A

2095-1833(2017)04-0021-08