朱广双 胡元亮 曹 侃 王本忠

(1.芜湖职业技术学院生物工程学院，芜湖241003；2.南京农业大学动物医学院，南京210095)

硫酸化银耳多糖和党参多糖对鸡T淋巴细胞增殖及白细胞介素-2 mRNA表达水平的影响

朱广双1胡元亮2*曹 侃1王本忠1

(1.芜湖职业技术学院生物工程学院，芜湖241003；2.南京农业大学动物医学院，南京210095)

为研究硫酸化银耳多糖(sTPS70c)和硫酸化党参多糖(sCPPS50c)增强免疫作用机理，本试验以未修饰银耳多糖(TPStp)为对照，采用噻唑蓝(MTT)法和实时荧光定量PCR法测定了sTPS70c和sCPPS50c对鸡T淋巴细胞增殖及白细胞介素-2(IL-2)mRNA表达水平的影响。结果表明，多糖单独加入到外周血淋巴细胞时，sTPS70c和sCPPS50c几乎所有浓度均可显著刺激T淋巴细胞的增殖(P<0.05)，而TPStp仅在浓度为3.125 μg/mL时显著刺激T淋巴细胞增殖(P<0.05)；多糖与植物血凝素P(PHA-P)同时加入到外周血淋巴细胞时，sCPPS50c在浓度为0.391～1.563 μg/mL时显著刺激T淋巴细胞增殖(P<0.05)；sTPS70c和sCPPS50c在浓度为1.563 μg/mL时可提高T淋巴细胞IL-2 mRNA的表达水平(P<0.05)，其中sTPS70c对IL-2 mRNA的促表达作用显著强于TPStp(P<0.05)，且在浓度为1.563 μg/mL时的作用最强。结果提示，硫酸化修饰可以提高多糖的淋巴细胞增殖活性及显著增强IL-2 mRNA的表达，且以sTPS70c的作用较强，这与取代度有一定的相关性。

硫酸化银耳多糖；硫酸化党参多糖；淋巴细胞增殖；白细胞介素-2

硫酸化修饰可以进一步提高多糖的生物活性，并能产生许多新的药用价值，尤其是赋予或增强多糖的抗病毒和免疫活性，因此倍受关注。硫酸化多糖可通过多途径、多层面发挥免疫增强作用。研究证明，硫酸化多糖主要通过激活T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞、树突状细胞及巨噬细胞等免疫细胞，促进细胞因子分泌等方式和途径来实现对免疫系统的调节作用[1-3]。

白细胞介素-2(IL-2)是T淋巴细胞活化产生的细胞因子，能促使B淋巴细胞分化和分泌抗体，诱导机体产生干扰素，提高单核细胞以及NK细胞的活性，在免疫反应中发挥重要的调节功能[4-5]。因此，在前期研究[6-7]的基础上，为了进一步了解硫酸化多糖增强免疫作用及探讨其作用机理，本试验采用噻唑蓝(MTT)法和实时荧光定量PCR法测定硫酸化银耳多糖(sTPS70c)和硫酸化党参多糖(sCPPS50c)对鸡T淋巴细胞增殖及IL-2 mRNA表达水平的影响，研究sTPS70c和sCPPS50c的免疫增强作用并筛选出1种免疫活性较强的硫酸化多糖。

1 材料与方法

1.1 试验试剂

RPMI1640培养基购自Gibco公司；小牛血清为浙江天杭生物科技有限公司产品；植物血凝素P(PHA-P)购自Sigma公司；淋巴细胞分离液为上海华精生物科技发展公司产品；二甲亚砜(DMSO)购自天津科密欧化学试剂公司；RNAiso Plus、Taq酶、5×Taq buffer和2.5 mmol/L氯化镁(MgCl2)试剂均购自TaKaRa公司；DEPC水为南京寿康生物技术有限公司产品；SYBR Green Ⅰ Master Mix购自日本Toyobo公司；10 mmol/L脱氧核苷三磷酸(dNTP)购自上海捷倍思生物技术有限公司；IL-2和磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)引物由南京金斯瑞生物科技有限公司设计；DNA Marker和离心柱型PCR产物纯化试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司。

1.2 试验药物

sTPS70c、sCPPS50c和未修饰银耳多糖(TPStp)由南京农业大学中兽医研究室提供。根据前期试验结果，sTPS70c、sCPPS50c和TPStp分别用无小牛血清的RPMI1640培养液稀释成6.250、3.125、1.563、0.782和0.391 μg/mL 5个浓度，以0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，4 ℃保存备用。

1.3 鸡T淋巴细胞的分离及培养

成年公鸡无菌心脏采血(肝素抗凝)30 mL，Hank’s液稀释后加入淋巴细胞分离液上层，2 000 r/min离心20 min，吸取中间云雾状细胞，Hank’s液洗涤，1 500 r/min离心10 min。细胞计数后，调整细胞密度为2.5×106个/mL，每孔80 μL细胞液加入96孔细胞培养板，然后加入各浓度的sTPS70c、sCPPS50c和TPStp100 μL，重复4孔，另加入终浓度为20 μg/mL PHA-P，并设多糖对照、细胞对照和PHA-P对照。置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养48 h，加入MTT 20 μL，继续培养4 h后，每孔加DMSO 100 μL，于酶联免疫检测仪上测定A570值，检测T淋巴细胞增殖能力[7-8]。

1.4 sTPS70c、sCPPS50c和TPStp对鸡T淋巴细胞IL-2 mRNA表达水平的测定

1.4.1 鸡T淋巴细胞的分离及培养

分离方法同1.3。调整细胞浓度为1×107个/mL，每孔800 μL细胞液加入到6孔细胞培养板，同时加入1.563～6.250 μg/mL的sTPS70c、sCPPS50c和TPStp各1 mL，然后加入200 μL PHA-P溶液(20 μg/mL)，另设细胞对照和PHA-P对照，在37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养36 h后收集细胞于1.5 mL Eppendorf管，低温冷冻离心机中2 000 r/m离心10 min。弃上清，加1 mL磷酸缓冲液(PBS)混匀后再离心10 min。弃上清，-70 ℃保存，提取RNA备用。

1.4.2 鸡T淋巴细胞总RNA的提取

各Eppendorf管加入1 mL Trizol，振荡混匀后，室温放置10 min；向每管中加入200 μL氯仿，剧烈振荡，室温静置10 min；12 000 r/min低温离心15 min，取上清350 μL，加入等体积异丙醇，混匀，4 ℃放置20 min，然后12 000 r/min低温离心15 min，弃上清，用1 mL 75%乙醇洗涤沉淀，4 ℃下10 000 r/min离心5 min，弃上清，RNA沉淀室温干燥。用20 μL 0.1 % DEPC水溶解，-20 ℃冻存[9-10]。

1.4.3 反转录

以提取的总RNA为模板进行反转录，按照反转录试剂盒说明操作。将反转录产物于-20 ℃保存备用。

1.4.4 PCR引物的设计

根据GenBank上鸡IL-2(序列号：AJ224516.1)和GAPDH(序列号：NM204305)的RNA序列，由南京金斯瑞生物技术有限公司合成引物。分别扩增IL-2和GAPDH的138和146 bp片段[11]。

IL-2(138 bp)：上游，5′-AGGGGTGAATTCACAAGGG-3′；下游，5′-ACTTCTCCCAGGTAACAC-3′。

GAPDH(146 bp)：上游，5′-TGGAGAAACCAGCCAAGTAT-3′；下游，5′-CGCATCAAAGGTGGAAGAAT-3′。

1.4.5 实时荧光定量PCR的测定

反应体系：10 μL SYBR Green Ⅰ Master Mix，0.6 μL上游引物，0.6 μL下游引物，2 μL cDNA，加三蒸水定容至体积20 μL[12]。

反应条件：95 ℃预变性3 min，94 ℃ 30 s，特异退火温度30 s采集荧光信号，40个循环；并自60 ℃缓慢升温至99 ℃后分析熔解曲线。

1.5 数据统计与分析

采用比较Ct值法[13]，分别计算各样品中IL-2 mRNA相对表达水平，数据以平均值±标准误表示，用SPSS 16.0进行Duncan氏多重分析，比较各多糖作用下T淋巴细胞中IL-2的mRNA表达水平。

2 结果与分析

2.1 sTPS70c、sCPPS50c和TPStp对鸡T淋巴细胞增殖的影响

2.1.1 多糖单独作用对鸡T淋巴细胞增殖的影响

由表1可知，sCPPS50c在浓度为0.391～6.250 μg/mL、sTPS70c在浓度为0.782～6.250 μg/mL以及TPStp在浓度为3.125 μg/mL时的A570值与细胞对照相比差异显著(P<0.05)，显著高于细胞对照。sTPS70c和sCPPS50c的硫酸基取代度分别为1.62和1.36，表明它们在相应浓度明显促进鸡T淋巴细胞增殖的效果强于未修饰多糖，且与硫酸基取代度有关。

表1 多糖单独作用对鸡T淋巴细胞增殖的的影响Table 1 Effects of polysaccharides alone on proliferation of the T lymphocyte of broilers

同行数据肩标不同字母表示差异显著(P<0.05)。下表同。

In the same row, values with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

2.1.2 多糖协同PHA-P作用对鸡T淋巴细胞增殖的影响

由表2可知，sCPPS50c在浓度为0.391～1.563 μg/mL时的A570值显著高于PHA-P对照(P<0.05)，表明其在相应浓度能协同PHA-P作用显著促进鸡T淋巴细胞增殖。

表2 多糖协同PHA-P作用对鸡T淋巴细胞增殖的影响Table 2 Effects of polysaccharides cooperated with PHA-P on proliferation of T lymphocyte of broilers

2.2 鸡T淋巴细胞IL-2 mRNA表达水平

2.2.1 反应条件的优化

样本的扩增曲线为“S”形，扩增曲线之间间距均匀，标准曲线R2>0.99，标准曲线斜率差值<0.1，说明PCR反应扩增效率相对一致(图1)。溶解曲线分析表明，峰值单一，说明无非特异性产物和引物二聚体的峰值出现(图2)。

2.2.2 sTPS70c、sCPPS50c和TPStp对鸡T淋巴细胞IL-2 mRNA表达水平的影响

设PHA-P对照的2-△△Ct为1，与PHA-P对照比较，sTPS70c在浓度为1.563～6.250 μg/mL时鸡T淋巴细胞IL-2 mRNA表达水平分别为1.87、2.26和8.13；sCPPS50c在浓度为1.563～3.125 μg/mL时鸡T淋巴细胞IL-2 mRNA表达水平分别为1.80和3.32；TPStp在浓度为1.563和6.250 μg/mL时鸡T淋巴细胞IL-2 mRNA表达水平分别为1.52和1.83，表明各多糖均可以促进IL-2 mRNA的表达。

由图3可知，sTPS70c和sCPPS50c在浓度为1.563 μg/mL时鸡T淋巴细胞IL-2 mRNA表达水平与PHA-P对照相比差异显著(P<0.05)，sTPS70c在浓度为1.563 μg/mL时鸡T淋巴细胞IL-2 mRNA表达水平与TPStp差异显著(P<0.05)；sTPS70c在浓度为6.250 μg/mL、sTPS70c和sCPPS50c在浓度为3.125 μg/mL时鸡T淋巴细胞IL-2 mRNA表达水平高于TPStp，但差异不显著(P>0.05)，sTPS70c在浓度为1.563 μg/mL鸡T淋巴细胞IL-2 mRNA表达最强，且硫酸基取代度较高。

图1 样本扩增曲线和标准曲线Fig.1 Sample amplification curve and standard curve

图2 样本溶解曲线Fig.2 Sample dissolution curve

柱形标注不同字母表示差异显著(P<0.05)。Columns with different letter subscripts mean significant difference (P<0.05).

图3IL-2 mRNA表达水平

Fig.3IL-2 mRNA expression level

3 讨 论

淋巴细胞转化是反映细胞免疫最直接的指标[14]。本试验结果表明，多糖单独刺激T淋巴细胞时，sTPS70c和sCPPS50c几乎所有浓度、TPStp仅在浓度为3.125 μg/mL时显著促进T淋巴细胞增殖；多糖与PHA-P共同作用T淋巴细胞时，sCPPS50c在浓度为1.563 μg/mL时显著促进T淋巴细胞增殖；这表明硫酸化修饰后可以增强多糖的免疫活性。未经PHA-P刺激的淋巴细胞促增殖作用强于多糖与PHA-P协同作用，说明硫酸化多糖能单独刺激淋巴细胞增殖，且效果强于丝裂原。Nguyen等[15]研究发现，硫酸化黑木耳多糖sAAP1和sAAPt能单独或协同PHA-P促进外周血淋巴细胞增殖作用，硫酸化修饰可以显著提高细胞免疫作用。

多糖的硫酸基取代度与其增强免疫活性也有很大的关系。sTPS70c和sCPPS50c的硫酸基取代度分别为1.62和1.36，发现它们促进T淋巴细胞增殖的作用与较高的硫酸基取代度有关。有研究发现，硫酸化当归多糖促进脾淋巴细胞增殖的作用与其硫酸基取代度有一定的关系，取代度越高，作用越强[16]，这与本研究结果一致。可能是硫酸化修饰后多糖产生了新的结构，引起了多糖理化性质和立体构象的变化，从而显著提高了多糖的生物活性。

IL-2能激活多种免疫细胞，诱导淋巴细胞的增殖与免疫效应，在细胞免疫中是免疫调节作用的核心[17]。因此，通过分析IL-2 mRNA的表达水平，可以对外周血中T淋巴细胞的活化程度进行初步评价，并反映机体的细胞免疫状态[18]。本试验结果表明，2种硫酸化多糖sTPS70c和sCPPS50c均在浓度为1.563 μg/mL时IL-2 mRNA表达水平与PHA-P对照差异显著，可促进T淋巴细胞IL-2 mRNA的表达，但2种硫酸化多糖的表达水平有显著差异，sTPS70c在浓度为1.563 μg/mL时IL-2 mRNA表达水平与TPStp相比差异显著，可以显著促进外周血淋巴细胞中IL-2 mRNA的表达，表达最为丰富，从而促进IL-2的分泌，发挥增强免疫作用。有研究表明黄芪多糖对犬脾淋巴细胞IL-2、干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α) mRNA表达有显著增强作用，且IL-2和IFN-γ mRNA表达水平显著优于刀豆素A(ConA)[19]。

4 结 论

sTPS70c和sCPPS50c均可以提高多糖的淋巴细胞增殖活性并显著增强IL-2 mRNA的表达，且以sTPS70c的作用较强，可作为潜在的免疫增强剂开发利用。

致谢：

感谢山东农业大学动物科技学院赵晓娜博士对文稿所提的宝贵意见。

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*Corresponding author, professor, E-mail: ylhu@njau.edu.cn

(责任编辑 田艳明)

Effect of Sulfated Polysaccharidses fromTremellaandCondonpsispilosulaon T Lymphocyte Proliferation and mRNA Expression Level of Interleukin-2 of Broilers

ZHU Guangshuang1HU Yuanliang2*CAO Kan1WANG Benzhong1

(1.CollegeofBiologicalEngineering,WuhuInstituteofTechnology,Wuhu241003,China; 2.CollegeofVeterinaryMedicine,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095,China)

In order to study the mechanism of sulfated polysaccharidses fromTremella(sTPS70c) andCondonpsispilosula(sCPPS50c) on immunological enhancement activity, the effects of sTPS70cand sCPPS50con T lymphocyte proliferation and the mRNA expression level of interleukin-2 (IL-2) were determined by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay and real-time fluorescent quantitative PCR assay while taking the unmodified polysaccharidses fromTremella(TPStp) as control. The results showed that in single adding into peripheral lymphocyte, sTPS70cand sCPPS50calmost at all concentrations and TPStp only at 3.125 μg/mL could significantly stimulate T lymphocyte proliferation (P<0.05). In simultaneous adding into peripheral lymphocyte with plant haemagglutinin P (PHA-P), sCPPS50cat 0.391 to 1.563 μg/mL significantly stimulated T lymphocyte proliferation (P<0.05). sTPS70cand sCPPS50calso could significantly promote mRNA expression level ofIL-2 in T lymphocyte at 1.563 μg/mL (P<0.05), and the promoting effects of sTPS70cwere significantly better than TPStp(P<0.05), especially at 1.563 μg/mL, the effect of sTPS70cwas the strongest. These results indicate that sulfated modification can enhance the lymphocyte proliferation and mRNA expression ofIL-2, and sTPS70cpresents more stronger action, which is related to the degree of substitution at a centain extent.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2017, 29(7)：2535-2540]

sulfatedTremellapolysaccharide; sulfatedCodonopsispilosulapolysaccharide; lymphocyte proliferation; interleukin-2

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.07.038

2017-03-23

安徽省教育厅自然科学重点项目(KJ2017A564)；安徽省教育厅自然科学重点项目(KJ2015A401)；校级自然科学研究项目“应用复方中草药防治猪场常见呼吸道疾病的研究”(wzyzr201619)；校级“教学质量与教学改革工程”项目(2016)

朱广双(1975—)，男，安徽芜湖人，讲师，硕士，研究方向为中兽医学。E-mail: 627990977@qq.com

*通信作者:胡元亮，教授，博士生导师，E-mail： ylhu@njau.edu.cn

S831

A

1006-267X(2017)07-2535-06