王少扬, 林涛发, 朱玲玲, 谢丽平

(南京军区福州总医院 感染科， 厦门大学附属东方医院 感染病学教研室， 福州 350003)

HBsAg和HBcAg联合负载DC与CIK共培养细胞体系的建立和功能评估

王少扬, 林涛发, 朱玲玲, 谢丽平

(南京军区福州总医院 感染科， 厦门大学附属东方医院 感染病学教研室， 福州 350003)

目的 观察在不同HBV抗原负载下诱导的树突状细胞(DC)同细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)共培养后CIK的功能。方法 将2015年1月-2016年6月在南京军区福州总医院就诊的13例慢性乙型肝炎患者作为研究对象，分离13例慢性乙型肝炎患者的外周血单个核细胞，并培养DC和CIK，设为CIK单独培养组、DC+CIK共培养组、DC+CIK+HBsAg共培养组、DC+CIK+HBcAg共培养组、DC+CIK+HBsAg+HBcAg共培养组，培养完成后，用ELISPOT方法测定CIK产生IFNγ的能力，用HepG2.2.15细胞作为靶细胞，测定CIK的杀伤功能。计量资料多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。 结果 不同CIK试验组产IFNγ的水平差异有统计学意义(F=29.84，P<0.001)，其中以DC+CIK+HBsAg+HBcAg组产生的IFNγ水平最高；CIK杀伤率组间比较差异有统计学意义(F=14.77，P<0.001)，其中以DC+CIK+HBsAg+HBcAg最为突出。结论 HBsAg和HBcAg联合负载的DC与CIK共培养可能是治疗慢性乙型肝炎有效的细胞体系。

肝炎， 乙型， 慢性； 肝炎表面抗原， 乙型； 肝炎核心抗原， 乙型； 树突细胞； 杀伤细胞

近几年树突状细胞(DC)联合细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer cell，CIK)在治疗肿瘤方面的研究进展迅速，特别是在相关抗原负载下的DC与CIK混合培养达到了相互协同增强各自免疫功能的目的，共培养后回输治疗恶性肿瘤显示出更加有效的临床疗效[1]。现也有学者尝试用不同的HBV抗原负载DC后再同自体CIK混合培养治疗慢性乙型肝炎，初步显示了一定的临床疗效，但用何种方式对DC负载培养两者的协同效能最佳还存在不同的意见，有必要进一步探讨。

1 资料和方法

1.1 研究对象 将2015年1月-2016年6月在南京军区福州总医院感染科门诊就诊或住院的13例慢性乙型肝炎患者作为观察对象，诊断标准符合《慢性乙型肝炎防治指南(2010版)》[2]，并排除HCV、HIV等合并感染及酒精性肝炎、自身免疫性肝炎和其他因素造成的肝功能异常者。13例患者中男9例，女4例，平均(37.0±11.5)岁。本研究获得所有患者的知情同意并通过医院伦理委员会的审核。

1.2 DC的培养 无菌条件下，由专职人员使用血细胞分离机采集患者自体外周血单个核细胞 (PBMC)，细胞数量达到(1～3)×108以上，必须保证每位患者一套采集管道。收集的PBMC 重悬于无血清培养基中，置于37 ℃，5%CO2培养箱孵育2 h，去除非贴壁细胞(培养CIK用)，加入rhGM-CSF 1000 U/ml和rhIL-4 1000 U/ml，刺激细胞向DC分化；第3天半量换液，并加入rhGM-CSF 1000 U/ml和rhIL-4 1000 U/ml；在培养的第6天，分别加入HBsAg、HBcAg、HBsAg和HBcAg各1 μg/ml混合物，刺激抗原特异性的DC产生。

1.3 CIK的培养及鉴定 收集的PBMC重悬于无血清培养基中，置于37 ℃，5%CO2条件下孵育2 h，收集非贴壁细胞，加入IFNγ 1000 U/ml培养，24 h 后加入CD3单克隆抗体1 μg/ml和rhIL-2 2000 U/ml，刺激CIK的生长和增殖；第3天进行一次传代培养并补充rhIL-2 2000 U/ml；第7天收获CIK，台盼蓝染色检测细胞活力应在80%以上，用流式细胞仪检测细胞免疫表型CD3、CD3+CD8+和CD3+CD56+等的表达。

1.4 DC和CIK共培养及鉴定 收集培养第7天的抗原负载的DC及CIK按1∶10 比例共培养，加入2000 U/ml rhIL-2，每3 d补充培养基及rhIL-2 2000 U/ml，第7天收集细胞，其数量应达到1×1010个以上，台盼蓝染色检测细胞活力应在80%以上，同时采用流式细胞仪检测细胞免疫表型CD3、CD3+CD8+和CD3+CD56+等的表达。

1.5 酶联免疫斑点测定法检测CIK产IFNγ的水平分别设立DC+CIK共培养组、DC+CIK+HBsAg共培养组、DC+CIK+HBcAg共培养组、DC+CIK+HBsAg+HBcAg共培养组，并设正对照孔(CIK+植物血凝素组)、负对照孔(CIK组)，每组设5个复孔，细胞接种于96孔板，终体积100 μl，按说明书逐步操作，并计算斑点数，记录结果。

1.6 CIK的杀伤功能检测 以HepG2.2.15细胞为靶细胞，效应细胞设立5组，分别为CIK单独培养组、DC+CIK共培养组、DC+CIK+HBsAg共培养组、DC+CIK+HBcAg共培养组、DC+CIK+HBsAg+HBcAg共培养组；RPMI1640重悬效应细胞浓度为1×106/ml，靶细胞浓度为1×105/ml。将效应细胞和靶细胞按10∶1比例混合，培养于96孔板中，终体积200 μl，将细胞培养板置于37 ℃、5% CO2孵育箱中培养24 h后，每孔加入10 μl CCK-8试剂，继续孵育2 h。结果以DU 800分光光度仪，波长450 nm测量的吸光度(OD值)表示；杀伤率的计算：杀伤率=1-[(实验组OD值-效应组OD值)/靶细胞组OD值]。

2 结果

2.1 不同CIK试验组产IFNγ水平比较 多组间IFNγ水平差异有统计学意义(P<0.001)。进一步两两比较，各组之间IFNγ水平差异均有统计学意义(P值均<0.001)，其中DC+CIK+HBsAg+HBcAg组产生的IFNγ最多(表1)。

表1 不同CIK试验组产生IFNγ的水平

2.2 不同试验组CIK杀伤功能比较 CIK组、DC+CIK组、DC+CIK+HBsAg组、DC+CIK+HBcAg组、DC+CIK+HBsAg+HBcAg组的杀伤率依次分别为0.620±0.041、0.786±0.013、0.887±0.006、0.912±0.019、0.949±0.016，多组间比较差异有统计学意义(F=14.77，P<0.001)，进一步组间比较，差异也均有统计学意义(P值均<0.05)，其中DC+CIK+HBsAg+HBcAg组的杀伤率最高(图1)。

图1 不同分组CIK细胞杀伤功能的比较 *P=0.02, **P<0.001

3 讨论

慢性乙型肝炎的治疗主要是应用IFNα与核苷和核苷酸类药物，前者因仅有部分患者应答，且具有明显副作用，限制广泛应用；后者具有明显的抗病毒疗效，但长期用药易产生耐药，且停药后易复发，最为重要的是不能清除cccDNA，因此不能彻底清除病毒而达到治愈的目的，所以探讨新的治疗方法十分必要[2]。

目前DC和CIK治疗是最有潜力的细胞免疫治疗措施之一，有望能打破乙型肝炎患者的免疫耐受状态而达到彻底清除病毒的目的。DC是已知的体内最强的抗原递呈细胞，可以直接激活在体内的原始T淋巴细胞，这是诱导特异性免疫应答的关键环节[3]。研究证实慢性乙型肝炎患者存在DC功能的缺失，具体表现在细胞表面的共刺激分子CD80/CD86和人类白细胞抗原Ⅱ的表达减少，产生IL-12等细胞因子的能力、混合淋巴细胞反应能力降低，外周血单核细胞中产IFNγ的DC前体细胞的数量和功能也显著下降，而通过体外相关抗原的诱导可恢复和改善DC功能，具有抑制HBV复制的效果[4-6]。CIK细胞是一群异质细胞群体，主要效应细胞是CD3+CD56+细胞，既具有T淋巴细胞的功能，又具有自然杀伤细胞的功能，并且不具有主要组织相容性抗原的限制，在体外可以大量扩增复制，具有明显的临床应用价值，经临床观察也具有一定的抗HBV的作用[7]。这两类细胞已经在治疗肿瘤方面做了大量的基础和临床研究工作[8]。而在慢性乙型肝炎治疗方面，虽然已有许多探索性研究报道，但仍有许多问题有待解决。CIK所诱导的是非特异性免疫应答效应，虽然有一定的抑制HBV复制的疗效，但疗效多数是一过性的，不能长期维持，所以仅有部分患者产生临床疗效。DC可以诱导特异性免疫应答效应，并且维持持久的免疫应答能力，但是DC培养相对困难，并且细胞扩增的数量十分有限，难以达到临床治疗的需要。

在DC培养方面，如何给予抗原负载诱导也是决定DC功能恢复和增强的关键因素，现有多篇文献报道HBsAg、HBcAg具有更强的免疫应答效果，如Shi等[9]利用HBcAg作为负载抗原较HBsAg所产生的DC会诱导更强的细胞毒性T淋巴细胞应答效应，且诱导共刺激分子的表达，如CD80、CD83、CD1a等明显增强。Duan等[10]也做了类似的研究，以HBcAg负载的DC会诱导更强的特异性细胞毒性T淋巴细胞应答效应。笔者近期研究发现将HBsAg和HBcAg联合负载DC所产生的免疫应答能力高于单独抗原诱导。对DC和CIK混合培养，在肿瘤患者中研究发现，和单独培养相比，无论DC功能的恢复还是CIK功能的改善均有明显的提高，两者混合培养有明显的协同作用[11]。经本研究发现，同单独CIK培养相比，DC和CIK混合培养后CIK功能明显得到提高，产生IFNγ的能力明显优于CIK单独培养，CIK杀伤功能检测也发现混合培养的杀伤能力优于CIK单独培养，同时本研究发现HBsAg和HBcAg联合负载DC与CIK混合培养是提高CIK免疫功能的较佳方案。

以上研究提示将HBsAg和HBcAg联合负载DC与CIK混合培养后自体回输可能是治疗慢性乙型肝炎有效的措施，既具备特异性和持久的免疫应答效果，又具有广泛的非特异性免疫应答能力。当然，体外细胞的功能并不能完全替代细胞回输机体后的免疫功能表现，对临床的疗效还有待于进一步验证。

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引证本文：WANG SY, LIN TF, ZHU LL, et al. Establishment and functional evaluation of DC-CIK co-culture system with combined loading of HBsAg and HBcAg[J]. J Clin Hepatol, 2017, 33(7): 1280-1283. (in Chinese) 王少扬, 林涛发, 朱玲玲, 等. HBsAg和HBcAg联合负载DC与CIK共培养细胞体系的建立和功能评估[J]. 临床肝胆病杂志, 2017, 33(7): 1280-1283.

(本文编辑：王亚南)

Establishment and functional evaluation of DC-CIK co-culture system with combined loading of HBsAg and HBcAgWANGShaoyang,LINTaofa,ZHULingling,etal.

(DepartmentofInfectiousDiseases,FuzhouGeneralHospitalofNanjingMilitaryAreaCommand,Fuzhou350003,China)

Objective To investigate the function of cytokine-induced killer cell (CIK) after co-culture of dendritic cells (DC) and CIK loaded with different HBV antigens. Methods A total of 13 patients with chronic hepatitis B (CHB) who visited Fuzhou General Hospital of Nanjing Military Area Command from January 2015 to June 2016 were enrolled. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated from 13 CHB patients, and DC and CIK were cultured and divided into CIK culture group, DC+CIK co-culture group, DC+CIK+HBsAg co-culture group, DC+CIK+HBcAg co-culture group, and DC+CIK+HBsAg+HBcAg co-culture group. Then ELISPOT assay was performed to measure the ability of CIK to produce pegylated interferonγ (IFNγ), and HepG2.2.15 cells were used as target cells to measure the killing function of CIK. A one-way analysis of variance was used for comparison of continuous date between groups, and the least significant differencet-test was used for further comparison between any two groups. Results There was a significant difference in IFNγ level between different CIK test groups (F=29.84,P<0.001), and the DC+CIK+HBsAg+HBcAg group had the highest IFNγ level. There was a significant difference in CIK killing rate between groups (F=14.77,P<0.001), and the DC+CIK+HBsAg+HBcAg group had the highest CIK killing rate. Conclusion DC-CIK co-culture with combined loading of HBsAg and HBcAg may be an effective cell system for the treatment of CHB.

hepatitis B, chronic; hepatitis B surface antigen s; hepatitis B core antigens; dendritic cells; kill cells

10.3969/j.issn.1001-5256.2017.07.015

2017-01-24；

2017-02-14。

福建省科技计划项目重点项目(2013Y0073)

王少扬(1969-)，男，副主任医师，博士，主要从事病毒性肝炎防治的临床和基础研究。

R512.62

A

1001-5256(2017)07-1280-04