刘长姣，王磊，杨柳，孟宪梅

(吉林工商学院 食品工程学院，长春 130507)

分光光度法测定香肠中亚硝酸盐含量的不确定度评定

刘长姣，王磊，杨柳，孟宪梅*

(吉林工商学院 食品工程学院，长春 130507)

评定分光光度法测定香肠中亚硝酸盐含量的不确定度。根据GB/T 5009.33-2010中亚硝酸盐的测定原理和方法，建立相应的数学模型，运用测量不确定度评定的基本方法，对模型中各影响因素的不确定度进行计算和评定。结果表明：香肠样品液中亚硝酸盐的质量引入的不确定度最大，是合成不确定度的主要来源。其中亚硝酸盐曲线拟合引入的不确定度Urelsam(C)是各分量中引入不确定度最大的一项；当取置信概率为95%时，最终得到测量的扩展不确定度为0.095 mg/kg (k=2)。该方法对分光光度法测定香肠中亚硝酸盐含量结果的不确定度评定具有参考作用。

亚硝酸盐；不确定度；分光光度法；香肠

亚硝酸盐是一种常用于肉类制品中的发色剂，同时又可以对产品起到防腐剂的作用，因此在香肠、罐头等制品中多有使用。虽然亚硝酸盐对改善产品色泽和延长食品保质期有较好的作用，但其可以降低人体血红蛋白载血的能力，诱发人体消化系统癌变[1,2]，因此对食品中亚硝酸盐添加量有严格要求，这也对食品中亚硝酸盐含量的测定提出了更高的要求。目前亚硝酸盐的测定方法有光谱法、色谱法和电化学[3]，其中光谱法中的分光光度法是GB 5009.33-2010《食品中亚硝酸盐和硝酸盐的测定》中亚硝酸盐测定的第二法[4]，本文利用此方法测定香肠中亚硝酸盐的含量，并根据JJF 1059-1999《测量不确定度评定与表示》[5]，对分光光度法测定香肠中亚硝酸盐含量结果的不确定度进行了计算和评定，为评定测量结果质量提供了科学依据，同时为亚硝酸盐在香肠等肉制品中的含量测定、结果表达和测定结果质量评定等提供了科学的指导[6]。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

香肠：市售农家香肠；亚硝酸钠：北京化工有限公司；氨基苯磺酰胺和盐酸N-(1萘)-乙二胺：分析纯；TU-1810紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司。

1.2 方法

1.2.1 测定条件

1.2.1.1 标准溶液的配制

准确称取0.1000 g亚硝酸钠(硅胶干燥器中干燥24 h)，加水溶解，移入500 mL容量瓶中，加水定容并混匀。临用前，吸取亚硝酸钠标准溶液5.0 mL，置于200 mL容量瓶中，加水定容得亚硝酸钠标准使用溶液。

1.2.1.2 标准曲线的绘制

分别吸取0，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00，1.50，2.00，2.50 mL亚硝酸钠标准使用液于50 mL带塞比色管中。分别加入2 mL对氨基苯磺酸溶液，混匀，静置3～5 min后各加入1 mL盐酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混匀，静置15 min，用2 cm 比色杯，以零管调节零点，于波长538 nm处测吸光度，以浓度和吸光度值进行曲线拟合，得到线性回归方程：Y=0.0164X-0.005，线性范围：0～12.5 μg。

1.2.2 样品处理

称取5 g(精确至0.01 g)制成匀浆的试样置于50 mL烧杯中，加12.5 mL饱和硼砂溶液，搅拌均匀，以70 ℃左右的水约300 mL将试样洗入500 mL容量瓶中，于沸水浴中加热 15 min，取出置冷水浴中冷却，并放置至室温。加入5 mL亚铁氰化钾溶液, 摇匀, 再加入5 mL乙酸锌溶液, 以沉淀蛋白质。加水至刻度, 摇匀, 放置30 min,除去上层脂肪, 上清液用滤纸过滤,弃去初滤液30 mL,滤液备用。吸取40.0 mL上述滤液待测。

2 数学模型建立与不确定度来源分析

2.1 建立数学模型

依据实验分析分光光度法测定食品中亚硝酸盐含量的过程，结果以mg/kg表示，建立数学模型如下：

式中：X为香肠样品中亚硝酸盐的含量，mg/kg;m为香肠样品的质量，g；C为测量用样品液中亚硝酸盐的质量，μg；V1为样品提取液定容的体积，mL；V2为测量用样液的体积，mL。

2.2 测定不确定度来源分析

根据分光光度法测定香肠中亚硝酸盐含量的实验过程，并结合计算结果的数学模型，分析可得：影响亚硝酸盐含量测定的不确定度分量包括样品液中亚硝酸盐的质量、样品液定容体积的不确定度、样品质量的不确定度和测量用样液体积的不确定度。

样品液中亚硝酸盐质量的不确定度与标准样品纯度，配制标准使用溶液用玻璃量器称量和移取、吸光度拟合直线方程求样品液中亚硝酸盐质量的不确定度等有关。样品液定容体积和测量用样液体积的不确定度与定容时使用的容量瓶体积的不确定度等有关。样品称量质量的不确定度与样品称量的最大允许差和重复性误差有关。

3 不确定度分量的评定

3.1 样品液中亚硝酸盐质量的不确定度Urelsam(C)

3.1.1 标准样品配制带来的不确定度urelstd(C)

3.1.1.1 标准样品纯度带来的不确定度urel1(C)

相对不确定度为：urel1(C)=u(C)/P=0.00289/0.995=0.0029。

3.1.1.2 标准使用溶液配制带来的不确定度urel2(C)

标准使用溶液带来的不确定度包括标准物质称量带来的不确定度，稀释过程选用吸量管和定容用容量瓶带来的不确定度，包括500 mL和200 mL容量瓶各1个，5 mL吸量管1支。

a.标准物质称量不确定度urel2(m)

相对标准不确定度urel2(m)=u2(m)/m=0.0577/100.0=0.000577。

b.容量瓶体积(500 mL)带来的不确定度urel2(V)

温度引起体积变动的不确定度u2(T)：温度引起体积的变动分为容器体积膨胀和溶液体积膨胀。液体膨胀明显大于容量瓶的体积膨胀，因此只考虑溶液体积膨胀。实验室内温度变动±4 ℃，水的膨胀系数为2.1×10-4℃-1，按95%置信概率区间时，产生的体积变化量=体积×膨胀系数×ΔT=500×2.1×10-4×4=0.421 mL，u2(T)=(500× 2.1×10-4× 4)/1.96=

0.2143 mL。

所以容量瓶体积带来的不确定度urel2(V)= [u22(V)+u22(T)]1/2/V=0.0005168。

c.容量瓶体积(200 mL)带来的不确定度urel3(V)

温度引起体积变动的不确定度u3(T)：考虑溶液体积膨胀。实验室内温度变动±4 ℃，水的膨胀系数为2.1×10-4℃-1，按95%置信概率区间时，产生的体积变化量=体积×膨胀系数×ΔT=200×2.1×10-4×4=0.168 mL，则u3(T)=(200× 2.1×10-4× 4)/1.96=0.085714 mL；urel3(V)= [u32(V)+u32(T)]1/2/V=0.00060927。

d.吸量管校正不确定度urel4(V)

温度引起体积变动的不确定度u4(T):实验室内温度变动±4 ℃，水的膨胀系数为2.1×10-4℃-1。按95%置信概率区间时，产生的体积变化量=体积×膨胀系数×ΔT=5.0×2.1×10-4× 4=0.0042 mL，u4(T)=0.0042/1.96=0.00214；urel4(V)= [u32(V)+u32(T)]1/2/V=0.00291。

由3.1.1可得标准样品配制带来的不确定度：urelstd(C)= [urel12(C)+urel2(V)+urel32(V)+urel42(V)]1/2=0.00369。

3.1.2 标准曲线绘制使用吸量管和比色管带来的不确定度urelt(C)

3.1.2.1 吸量管校正不确定度urelt(V)

3.1.2.2 温度引起体积变动的不确定度urelt(T)

实验室内温度变动±4 ℃，水的膨胀系数为2.1×10-4℃-1。按95%置信概率区间时，产生的体积变化量=体积×膨胀系数×ΔT=5.0×2.1×10-4×4=0.0042 mL，urelt(T)=0.0042/1.96=0.00214。

由上述可得标准使用液移取带来的不确定度：urelt(C)= [urelt2(V)+urelt2(T)]1/2/V=0.00291。

3.1.3 曲线拟合过程带来的不确定度urelcur(C)

方程表示为y=bx+a，曲线斜率b=0.0146，曲线截距a=-0.005。

计算得us=0.2174 μg，urelcur(C)=us/y=0.2494/4.75=0.04577。

3.1.4 分光光度计测定亚硝酸盐的不确定度urelins(C)

根据上述各影响因素的不确定度计算样品液中亚硝酸盐质量的不确定度为：Urelsam(C)=[urelstd2(C)+urelt2(C)+urelcur2(C)+urelins2(C)]1/2=0.04630。

3.2 样品称量质量的测定不确定度Urelsam(m)

相对标准不确定度Urelsam(m)=usam(m)/m=0.057736/5000=0.0000114。

3.3 样品液定容体积带来的不确定度Urelsam(V1)

温度引起体积变动的不确定度usamt(T)：同上只考虑溶液体积膨胀。实验室内温度变动±4 ℃，水的膨胀系数为2.1×10-4℃-1，按95%置信概率区间时，产生的体积变化量=体积×膨胀系数×ΔT=500×2.1×10-4×4=0.421 mL；usamt(T)=(500× 2.1×10-4× 4)/1.96=0.2143 mL。

由上述可得样品液定容体积带来的不确定度为：Urelsam(V1)= [usamv2(V1)+usamt2(V1)]1/2/V=0.0005168。

3.4 测量用样液体积的不确定度usamt(V2)

测量用样液利用50 mL量筒移取，因此包括量具校准的不确定度和温度变化引起体积变动的不确定度。

温度引起体积变动的不确定度usamt2(V2)：按95%置信概率区间时，产生的体积变化量=体积×膨胀系数×ΔT=50×2.1×10-4×4=0.042 mL。usam2(V2)=0.042/1.96=0.021 mL。

由上述可得样品液测定体积带来的不确定度为：

usamt(V2)= [usamt12(V2)+usamt12(V2)]1/2/V=0.002917。

4 结果报告

根据数学模型中各影响因子是乘除关系，并且各输入量不相关，则合成不确定度为：

U(X)=Urel(X)×X=0.050×0.95=0.0475 mg/kg。

评定其扩展不确定度，取置信概率95%，取包含因子k=2，则U=U(X)×2=0.095 mg/kg。

报告结果：分光光度法测定香肠中亚硝酸含量为(0.95±0.095) mg/kg。

5 讨论

本文通过对香肠中亚硝酸盐含量计算模型中各因素进行不确定度分析，根据JJF 1059-1999《测量不确定度评定与表示》进行计算和合成。结果表明：当香肠中亚硝酸盐含量为0.95 mg/kg时，测量结果的扩展不确定度为0.095 mg/kg。相对不确定度分量见图1。

图1 合成相对不确定度分量

由图1可知，各不确定度分量中，样品液中亚硝酸盐质量的不确定度所占比例最大。

图2 urelsam(C)相对不确定度分量

注：1为urelstd(C)；2为urelt(C)；3为urelcur(C)；4为urelins(C)。

由图2可知，Urelsam(C)的各分量中，曲线拟合引入的不确定度Urelsam(C)比例最大。因此，在测定中要严格控制标准曲线的质量，从而可以得到质量更高的测定结果。

[1]PhillipsW E. Naturally occurring nitrate and nitrite in foods in relation to infant methaemoglobinaemia[J].Food and Cosmetics Toxicology,1971,9(2):219-228.

[2]Kelly J R,Duggan J M.Gastric cancer epidemiology and risk factors[J].Journal of Clinical Epidemiology,2003,56(1):1-9.

[3]孙震,钱和,蒋将.蔬菜中硝酸盐与亚硝酸盐检测方法的研究进展[J].食品与机械，2006,22(5):123-125.

[4]GB 5009.33-2010，食品中亚硝酸盐和硝酸盐的测定[S].

[5]JJF 1059-1999，测量不确定度评定与表示[S].

[6]中国实验室国家认可委员会.实验室认可与管理基础知识[M].北京：中国计量出版社，2003：176.

[7]JJG 196-2006，常用玻璃量器检定规程[S].

[8]何霜，李姗，叶嘉荣.微波消解-石墨炉原子吸收测定乳粉中铅的不确定度评定[J].广东化工，2015,42(20)：121-122.

[9]孟繁磊，牛红红，蔡红梅，等.分光光度法测定水中亚硝酸盐含量的不确定度评定[J].食品研究与开发，2016,37(9):174-177.

Uncertainty Evaluation of Nitrite Content in Sausage Detected by Spectrophotometry

LIU Chang-jiao, WANG Lei, YANG Liu, MENG Xian-mei*

(School of Food Engineering, Jilin Business and Technology College，Changchun 130507, China)

Evaluate the uncertainty of nitrite content in sausage detected by spectrophotometry. Mathematical model is established on the basis of the principle and method of nitrite determination in GB/T 5009.33-2010. The uncertainties of factors in mathematical model are analyzed and calculated. The results show that the uncertainty of nitrite in the quality is the largest in sausage sample liquid and it is the main source of compound uncertainty. Urelsam(C) is the main source of the component uncertainties, which is synthesized and extended. An expanded uncertainty of 0.095 mg/kg is obtained at the confidence probability of 95% and coverage factor of 2.The method provides reference for the uncertainty evaluation of nitrite content in sausage detected by spectrophotometry.

nitrite;uncertainty;spectrophotometry;sausage

2017-02-15 *通讯作者

吉林省教育厅“十二五”科学技术研究项目(2014439)

刘长姣(1981-)，女，辽宁通化人，讲师，博士，研究方向：天然产物有效成分提取与分离。

TS207.3

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.07.026

1000-9973(2017)07-0125-04