王娣，许晖，柯春林，李妍，曹珂珂，谢海伟

(蚌埠学院 生物与食品工程系，安徽 蚌埠 233030)

百里香多酚的提取工艺优化及抑李斯特菌活性研究

王娣，许晖，柯春林，李妍，曹珂珂，谢海伟

(蚌埠学院 生物与食品工程系，安徽 蚌埠 233030)

对百里香中多酚物质进行超声波辅助提取优化，并对其抑李斯特菌活性进行研究。选取超声温度、超声功率、超声时间、料液比4个影响因素，正交确定超声波辅助提取百里香多酚的最佳工艺条件，即超声温度50 ℃、超声功率400 W、超声时间25 min、料液比1∶15，多酚提取率8.36%。百里香多酚提取物对单增李斯特菌有抑菌作用。

百里香；超声辅助提取；李斯特菌；抑菌活性

百里香(Thyme)属于唇形科，为多年生草本植物或小灌木，原产于地中海沿岸，后逐渐被许多国家引种栽培[1]。百里香属植物种类繁多，化学成分主要有挥发油类(或芳香油类)、多酚类以及其他成分[2-5]。其中，百里香多酚具备显著的生理及药理活性，有抗菌、抗氧化、抗癌、抗肿瘤以及预防心血管疾病等功效，一直备受关注[6,7]。超声波提取技术能有效破碎细胞，加速细胞内溶质的溶出和扩散，有缩短提取时间、保护活性成分的作用，因而被广泛运用于天然产物提取[8-11]。本实验以百里香茎叶为实验材料，采用超声波辅助提取百里香中的多酚类物质，并对其抑李斯特菌活性进行初探，以期为我国百里香属植物的活性成分的开发利用提供一定理论依据。

1 实验材料与方法

1.1 材料与仪器

百里香(市售)；单增李斯特菌(中科院微生物所，编号：1.10753)；没食子酸(标准品)；胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)；胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)；其他试剂为分析纯。

DY881-8 干燥箱；FW100 粉碎机；GB-303 电子天平；SB25-12DTD 超声波机；UV1102紫外-可见分光光度计；HH-5 恒温水浴锅；RE-2000B 旋转蒸发器；LDZX-50KB 蒸汽灭菌器；GNP-9080 微生物培养箱等。

1.2 实验方法

1.2.1 原料预处理

取百里香茎叶若干，低温下烘干，粉碎机粉碎过60目筛避光备用。

1.2.2 百里香多酚提取方法

称取5.0 g百里香粉于烧瓶中(3组平行)，加入80%乙醇溶液，在不同温度、不同功率下超声波浸提一段时间，接着以4000 r/min离心15 min，分离上清液备用。同样方法重复2 次提取残渣，合并提取液，在45 ℃下真空旋转蒸发，定容，测定多酚含量，计算百里香多酚的提取率。

式中：C为提取液多酚浓度，mg/mL；V为提取液体积，mL；m为百里香质量，g。

1.2.3 标准工作曲线

采用福林酚法进行测定。准确称取没食子酸0.001 g，加蒸馏水溶解于500 mL的容量瓶中，定容，摇匀。分别吸取1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL没食子酸标准溶液于50 mL容量瓶中，加入FC试剂6.0 mL，摇匀，再加入24.0 mL 10% Na2CO3溶液，用蒸馏水定容，于30 ℃下避光放置2 h，在760 nm波长下测吸光度，得标准曲线，见图1，回归方程为：Y=0.1042X+0.006(R2=0.9940)[12]。

图1 没食子酸标准工作曲线

1.2.4 单因素实验

分别以不同超声温度(30，40，50，60，70 ℃)、不同超声功率(200，250，300，350，400 W)、不同超声时间(5，10，15，20，25 min)、不同料液比(1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25)为影响因素，研究其对百里香多酚提取的影响。

1.2.5 正交实验优化

正交实验因素水平见表1。

表1 正交实验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal design

1.2.6 抑菌活性研究

将单增李斯特菌接种于TSB中，37 ℃下160 r/min 培养过夜后，5 ℃下3500 r/min离心15 min，取菌体用0.85%生理盐水稀释，使菌悬液浓度达到106cfu/mL ，备用。在无菌条件下，用微量移液器吸取适量的菌悬液于TSA中涂布均匀。采用孔径为6 mm 的牛津杯，用倍比稀释法将百里香多酚粗品加0.5%吐温80，加无菌水稀释至100～3.125 mg/mL 6个浓度梯度，每孔加入100 μL提取物，做3次重复，以0.5%吐温80作空白对照，37 ℃下培养20 h，测量抑菌圈直径，3次平行实验取平均值。

2 结果和分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 超声温度对百里香多酚提取的影响

图2 超声温度对百里香多酚提取率的影响

由图2可知，随着超声温度的提高，多酚提取率在逐渐增加，在60 ℃时达到最大值，可能因为温度的上升导致分子运动加剧，扩散变快；但温度超过60 ℃，多酚提取率反而略下降，因此选择超声温度60 ℃为宜。

2.1.2 超声功率对百里香多酚提取的影响

图3 超声功率对百里香多酚提取的影响

由图3可知，随着超声功率的增加，百里香多酚提取率在逐渐增加，在350 W时达到最大值并趋于平衡，超声功率的增加可能导致细胞壁被破碎，百里香多酚从细胞扩散到溶液中量在也逐渐增加，因此选择超声功率350 W为宜。

2.1.3 超声时间对百里香多酚提取的影响

图4 超声时间对百里香多酚提取的影响

由图4可知，随着超声时间的增加，百里香多酚提取率逐渐增加，在20 min达到最大值，再继续延长超声时间，百里香多酚提取率基本不变，因此选择超声时间20 min为宜。

2.1.4 料液比对百里香多酚提取的影响

图5 料液比对百里香多酚提取的影响

由图5可知，百里香多酚提取率随着料液比的增加在逐渐增加，在料液比为1∶15时达到最大值，再继续增加料液比，百里香多酚提取率基本趋于平缓不再上升，因此选择料液比1∶15为宜。

2.2 正交实验

以料液比、超声时间、超声功率、超声温度为四因素，做三水平的正交实验，选择L9(34)正交表，实验结果见表2。

表2 正交实验分析Table 2 Analysis of the orthogonal experiment

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

由表2和表3可知，极差C>B>A>D，因此各因素对百里香多酚提取的影响为，提取时间>超声功率>提取温度>料液比，得出百里香多酚提取的最优化条件：A1B3C3D2，即提取温度为50 ℃，提取功率为400 W，提取时间为25 min，料液比为1∶15，在此条件下提取3次求平均值，得到多酚的提取率为8.36%。方差结果表明超声温度对百里香多酚的提取具有显著性。

2.3 百里香多酚的抑菌活性研究

百里香多酚提取物抑制李斯特菌活性见表4。

表4 百里香多酚抑制李斯特菌活性Table 4 Antibacterial activity to Listeria monocytogenesof polyphenols from thyme

注：“-”表示无抑菌圈出现。

抑菌实验结果表明：100 mg/mL百里香多酚提取物对李斯特菌抑菌作用较强，抑菌圈直径为15.23 mm。但是倍比稀释后，其抑菌活性也逐渐减弱，3.125 mg/mL多酚提取液则没有抑菌活性。国内外学者研究表明：百里香中的酚类物质，尤其是百里香酚(Thymol)和香芹酚(Carvacrol)，是具有抑菌活性的物质，其抑菌机理可能是降解细胞壁、损伤细胞膜、对微生物DNA的作用、菌体呼吸能量代谢的影响等[13-16]。

3 结论

超声波辅助提取百里香多酚的最佳提取工艺为：超声温度50 ℃、超声功率400 W、超声时间25 min、料液比1∶15、多酚提取率8.36%。百里香多酚的抑菌活性研究表明其对单增李斯特菌有明显抑制作用。

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Extraction Process Optimization of Polyphenols from Thyme and Their Antibacterial Activity toListeriamonocytogenes

WANG Di, XU Hui, KE Chun-lin, LI Yan, CAO Ke-ke, XIE Hai-wei

(Department of Biology and Food Engineering, Bengbu College, Bengbu 233030, China)

The ultrasonic-assisted extraction process of polyphenols from thyme is optimized, and the antibacterial activity toListeriamonocytogenesof polyphenols is studied. Using thyme as experimental materal, ultrasonic temperature, ultrasonic power, ultrasonic time and solid-liquid ratio are optimized to obtain the optimal process conditions.The results show that the optimal extraction parameters are as follows: ultrasonic temperature is 50 ℃,ultrasonic power is 400 W, ultrasonic time is 25 min and solid-liquid ratio is 1∶15, the extraction rate of polyphenols reaches up to 8.36%. The polyphenols from thyme show antibacterial activity toListeriamonocytogenes.

thyme;ultrasonic-assisted extraction;Listeriamonocytogenes;antibacterial activity

2017-01-08

安徽省教育厅重点科研项目(KJ2015A204)；安徽省级质量工程项目(2014jyxm392)

王娣(1976-)，女，副教授，硕士，研究方向：食品生物技术。

TS201.1

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.07.014

1000-9973(2017)07-0063-04