王 驰 张久亮 尧 咏 聂素萍 胡 君 何 慧

(华中农业大学食品科学技术学院；环境食品学教育部重点实验室，武汉 430070)

富硒玉米蛋白水解物抗氧化活性研究

王 驰 张久亮 尧 咏 聂素萍 胡 君 何 慧

(华中农业大学食品科学技术学院；环境食品学教育部重点实验室，武汉 430070)

为了对SeCPHs的抗氧化活性进行研究，通过老龄小鼠模型以及HepG2细胞模型考察了普通玉米肽(CPs)、富硒玉米肽(SeCPs)以及甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys)的抗氧化活性。结果表明，采用SeCPs(400 mg/kg)连续灌胃30 d后，老龄小鼠血清中SOD、MDA、GSH-Px、T-AOC以及胸腺指数等指标均有显著改善，总抗氧化能力比CPs高13.38%，说明硒对抗氧化活性有重要贡献；当硒含量相等时，玉米肽比氨基酸的总抗氧化能力高15.79%。在HepG2细胞模型中，高含硒量的MeSeCys能极显著提高细胞增殖率。在改善细胞培养液中的ALT、AST和细胞中的SOD、GSH指标方面，MeSeCys组(硒含量0.5 μg/mL)和SeCPs+MeSeCys组(硒含量0.25 μg/mL)均有极显著效果，且水平相当，说明高含硒量化合物与玉米肽间具有协同抗氧化作用。

富硒玉米肽 甲基硒代半胱氨酸 抗氧化

选择H2O2对HepG-2细胞造成氧化损伤建立模型，旨在探究SeCPs以及SeMeCys对HepG-2细胞的保护作用，并初步探究其机理。选择自然生长的老龄鼠作为动物模型，研究SeCPs和SeMeCys对体内综合抗氧化能力的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

玉米肽：选用恩施鱼塘坝地区种植的普通玉米和高硒玉米样品各1个，制备玉米肽，通过原子荧光检测其硒含量分别为0.103 mg/kg和9.891 mg/kg，根据湖北省富硒食品地方标准，固体富硒食品硒含量需达到0.15 mg/kg，因此以上2种样品分别为CPs和SeCPs。SeMeCys：湖北恩施硒谷源实业有限公司。昆明种老龄小鼠，雄性，SPF级：湖北省疾病预防控制中心实验动物中心。HepG2人体肝癌细胞：华中科技大学同济医学院药学院。

碱性蛋白酶(Alcalase 3.0T)：丹麦诺维信公司；培养基DMEM：美国Hyclone公司；胎牛血清：杭州四季青生物工程有限公司；胰蛋白酶：美国Amresco公司；GSH、ALT、AST、LDH、SOD、T-AOC、GSH-Px、MDA、Annexin V-FITC试剂盒：南京建成生物工程研究所。

Multiskan Go全波长酶标仪：美国Thermo Fisher Scientific公司； FACSCalibur流式细胞仪：美国Becton Dickinson公司。

1.2 试验方法

1.2.1 玉米肽的制备

[12]的方法制备。

1.2.2 动物分组与喂养

老龄(12月龄)雄性昆明鼠60按其体重随机分成6组：空白对照组、CPs组、SeCPs组、SeMeCys组、SeCPs+SeMeCys组和白藜芦醇组。另取10只少龄(1月龄)雄性昆明小鼠(18～22 g)作为对照。其中2个对照组每日灌胃生理盐水，其他各组每日分别灌胃400 mg/kg CPs、400 mg/kg SeCPs、10 μg/kg SeMeCys、200 mg/kg SeCPs+5 μg/kg SeMeCys、10 mg/kg白藜芦醇。在各组别设计中，SeCPs组、硒代氨基酸组以及SeCPs+硒代氨基酸组其硒含量相等。

1.2.3 血清和胸腺样本获取及相关指标测定

分组喂养30 d后处死所有小鼠，眼眶取血，取胸腺称重，血浆于12 000 r/min，4 ℃低温离心10 min，取血清。按试剂盒说明书分别测定血清中GSH-Px、T-AOC、SOD活力和MDA含量。

1.2.4 SeCPHs对HepG2细胞的毒性作用

取对数期生长的HepG2细胞，用胰蛋白酶消化成悬液后，稀释至浓度约为7×104个/mL，以每孔100 μL接种于96孔板内。将培养板置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养12 h，待细胞贴壁后，吸弃上清液。试验组分别加入100、200、400、600、800、1 000、2 000 μg/mL CPs、SeCPs和0.01、0.1、1、10、50、100 μg/mL SeMeCys各100 μL，另设空白调零组不接种细胞但添加培养液，以及对照组接种细胞但不加药处理。每组设6个复孔，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h。小心吸弃孔内上清液，每孔加入200 μL 0.5 mg/mL 的MTT溶液，置于培养箱中继续培养4 h，吸弃上清液，每孔加入150 μL二甲亚砜(DMSO)，于酶标仪上慢速震荡10 min使甲臜颗粒充分溶解，而后选择490 nm波长，测定各孔吸光度值A490。试验重复3次后取平均值，按式(1)计算。

细胞增殖率=(试验组A570-空白组A570)/(对照组A570-空白组A570)×100%

(1)

1.2.5 MTT法测定SeCPHs对HepG2氧化损伤的保护作用

取对数期生长的HepG2细胞，处理同1.2.4。试验组每孔分别加入50、200、500、800 μg/mL的CPs和SeCPs以及0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10 μg/mL SeMeCys各100 μL，置于培养箱中培养24 h，吸弃上清液，每孔加入300 μmol/L的H2O2100 μL置于培养箱中处理2.5 h，另设空白调零组不接种细胞但添加培养液，对照组接种细胞但不加H2O2和其他药物处理，模型组加H2O2处理但不加SeCPHs预处理，每组设6个复孔。H2O2处理结束后按1.2.4方法加入MTT和DMSO测定吸光值A490。

1.2.6 流式细胞术检测细胞存活率

取对数期生长的HepG2细胞，处理同1.2.4。试验组每孔分别加入500 μg/mL的CPs、SeCPs、1 μg/mL SeMeCys以及上述SeCPs和SeMeCys各自减半混合溶液(V∶V=1∶1)2 mL后于培养箱中培养24 h，培养结束后，每孔加入H2O2调整终浓度至300 μmol/L的H2O2100 μL，置于培养箱中处理2.5 h，设对照组只加基础培养基处理，模型组加H2O2处理但不加其他药物处理，每组3个复孔。处理结束后按Annexin V-FITC试剂盒说明书进行流式细胞仪检测。

1.2.7 HepG2细胞培养液中ALT、AST和LDH活性的测定

取对数期生长的HepG2细胞，处理同1.2.4。试验组每孔分别加入2 mL 500 μg/mL的CPs、SeCPs、1 μg/mL SeMeCys以及上述SeCPs和SeMeCys各自减半混合溶液(V∶V=1∶1)、置于培养箱中培养24 h，然后每孔加入H2O2调整终浓度至300 μmol/L的H2O2100 μL，置于培养箱中处理2.5 h，设对照组只加基础培养基处理，模型组加H2O2处理但不加其他药物处理，每组3个复孔。培养结束后取上清液，按照试剂盒说明书测定其ALT、AST以及LDH的活性。

1.2.8 HepG2细胞中SOD活性和GSH含量测定

同1.2.7，各组经药物前处理和H2O2造模后，吸弃细胞培养液，每孔中加入500 μL RIPA裂解液在冰上裂解细胞，待细胞完全破碎后，收集细胞，按照试剂盒说明书测定细胞中SOD活性和GSH含量，蛋白质含量采用BCA试剂盒测定。

2 结果与讨论

2.1 小鼠一般情况观察

试验过程中，除少龄对照组小鼠体重缓慢增长外，其他各组老龄鼠体重较为稳定，试验前后体重差异无显著变化，且各组小鼠精神状态良好，活泼好动，表明所灌胃的CPs、SeCPs及硒代氨基酸对小鼠的体质均无明显影响。

2.2 小鼠血清中SOD活性及MDA含量测定结果

试验中各含硒组别其硒含量是相同的。由表1可以看出，与少龄对照组比较，老龄模型对照组的小鼠血清中SOD活性极显著下降(P<0.01)，MDA含量极显著上升。灌胃CPs(400 mg/kg)后，SOD和MDA指标有所改善，但不具有统计学差异；而灌胃同剂量的SeCPs后的老龄鼠血清内SOD活性极显著提升，MDA含量极显著下降至与阳性对照组白藜芦醇的效果相当；而仅灌胃SeMeCys的老龄鼠的SOD活性没有明显改善，但MDA含量显著下降(P<0.05)；采用SeCPs和SeMeCys(各自剂量减半)混合灌胃的老龄鼠血清SOD活性极显著升高，MDA含量亦有显著下降。

表1 血清中SOD活性及MDA含量

注：*和**分别表示相对于模型组有显著差异 (P<0.05)和极显著差异 (P<0.01)，余同。

2.3 小鼠胸腺指数及血清中T-AOC、GSH-Px活性

由表2可以看出，相对于老龄模型对照组，灌胃CPs的老龄鼠血清T-AOC活性显著提升(P<0.05)，GSH-Px活性极显著提升(P<0.01)；灌胃SeCPs的老龄鼠血清T-AOC和GSH-Px活性均有极显著提升，且升高幅度大于CPs；SeMeCys对于老龄鼠血清T-AOC活性没有明显改善，但能极显著提高GSH-Px活性，其效果与SeCPs相当；采用SeCPs和SeMeCys(各自剂量减半)混合灌胃的小鼠，其血清T-AOC和GSH-Px活性均有极显著提升。阳性对照组白藜芦醇对老龄鼠T-AOC活性具有显著提升作用，且效果远超其他各组，但其对GSH-Px活性的提升作用不及其他各给药组。

由表2可知，老龄鼠胸腺指数极显著小于少龄小鼠，灌胃CPs、SeCPs以及SeCPs+SeMeCys组后，小鼠胸腺指数显著增加(P<0.05)，与阳性对照组白藜芦醇效果大致相当。灌胃SeMeCys能极显著提高老龄鼠胸腺指数(P<0.01)，优于其他各组。

表2 小鼠胸腺指数及血清中T-AOC、GSH-Px活性

2.4 SeCPHs对HepG2细胞的毒性作用

在进行抗氧化试验前，首先需要研究原料本身对HepG2细胞是否有毒性作用。如图1所示，通过MTT试验结果表明CPs在100～1 000 μg/mL范围内，SeCPs在100～800 μg/mL范围内对细胞无直接毒性作用，超过此范围则细胞增殖受到了一定的抑制，故后续试验选用100～800 μg/mL。

图1 不同浓度的玉米肽处理对HepG2细胞的影响

由图2可知，SeMeCys在0.01～50 μg/mL范围内对细胞无直接毒性作用，超过50 μg/mL后，其对细胞生长有一定抑制作用，故后续试验选用0.01～50 μg/mL。

图2 不同浓度的SeMeCys处理对HepG2细胞的影响

2.5 玉米肽和硒代氨基酸对HepG2氧化损伤的保护作用

玉米肽预处理后H2O2损伤的HepG2细胞增值率如图3所示，经不同浓度玉米肽预处理后的HepG2细胞，其增值率相比于模型组均有一定程度的上升，并表现出良好的量效关系。其中200、500、800 μg/mL剂量的SeCPs均能极显著(P<0.01)提高细胞增殖率，500 μg/mL剂量的CPs亦能极显著提高细胞增值率，800 μg/mL CPs对细胞增值率有显著(P<0.05)提高作用，CPs和SeCPs组最佳预处理质量浓度均为500 μg/mL。且在有效浓度范围内，相同剂量下的SeCPs相对于CPs细胞增值率有显著提升(P<0.05)，其中500 μg/mL SeCPs组细胞增值率提升达24.16%，说明硒发挥了重要作用。

注：*和**分别表示相对于模型组有显著差异 (P<0.05)和极显著差异 (P<0.01)；#和##分别表示同等浓度SeCPs和CPs间有显著差异 (P<0.05)和极显著差异(P<0.01)。图3 不同浓度玉米肽预处理对H2O2损伤HepG2细胞增值率的影响

如图4所示，经不同浓度SeMeCys处理后的HepG2细胞增值率相比于模型组亦有一定程度上升，在0.01～0.05 μg/mL的范围内SeMeCys能显著提高HepG2细胞增值率(P<0.05)，0.1～10 μg/mL的SeMeCys对HepG2细胞的增值率有极显著提升效果(P<0.01)，其最佳预处理浓度为1 μg/mL，在该浓度下，细胞增值率相对于模型组提升了27.10%。

注：*和**分别表示相对于模型组有显著差异(P<0.05)和极显著差异(P<0.01)。图4 不同浓度SeMeCys预处理对H2O2损伤HepG2细胞存活率的影响

2.6 流式细胞术检测玉米肽及硒代氨基酸对HepG2细胞氧化损伤的保护

在流式细胞术测定细胞凋亡试验中，玉米肽组选用最佳剂量500 μg/mL，SeMeCys组选用最佳剂量1 μg/mL，SeCPs+SeMeCys组采用上述2组1∶1(V∶V)混合后剂量各自减半。经过Annexin V和PI同时处理后，正常细胞既不能被Annexin V染色也不能被PI染色，故出现在流式图中的左下象限；凋亡早期的细胞能被Annexin V染色，但不能被PI染色，故出现在右下象限；凋亡晚期的细胞和坏死的细胞能被Annexin V和PI同时染色，因此出现在右上象限。如图5所示，对照组大多为正常生长的细胞，集中在左下象限，占细胞总数的95.76%，说明在自然条件下，细胞的凋亡率很低。当使用H2O2对细胞进行处理后，细胞早期凋亡(右下象限)和晚期凋亡(右上象限)的数目都有所增加，尤以晚期凋亡的细胞增加更明显，说明H2O2对细胞的损伤主要是促进其晚期凋亡，正常细胞占比下降到73.04%，与空白对照组存在极显著差异(P<0.01)。经过CPs预处理后，晚期凋亡细胞显著减少(P<0.05)，早期凋亡细胞也略少于模型组；经过SeCPs预处理后早期凋亡细胞相比于CPs组显著减少(P<0.05)，晚期凋亡细胞极显著减少(P<0.01)，细胞增值率提升至89.14%；SeMeCys处理后的正常细胞比例在所有给药组中最高，与模型组相比存在极显著差异(P<0.01)，早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞均极显著减少(P<0.01)；SeCPs+SeMeCys处理细胞后的与SeCPs组相当。各给药预处理组相对于模型组晚期凋亡细胞减少明显，早期凋亡细胞略少于模型组。

表3 流式图参数

注：左下象限为正常细胞，右下象限为早期凋亡细胞，右上象限为晚期凋亡细胞。图5 玉米肽和硒代半胱氨酸预处理后H2O2损伤HepG2细胞的流式图

2.7 玉米肽及硒代氨基酸对H2O2损伤HepG2细胞培养液中ALT、AST、LDH的影响

由表4可知，模型组HepG2细胞经过2.5 h H2O2处理后，培养液中ALT、AST和LDH活性相对于空白对照组有极显著升高(P<0.01)，说明模型建立成功。CPs组相对于模型组ALT和AST活性显著降低(P<0.05)，LDH活性亦有降低，但不具有统计学意义；SeCPs组ALT、AST和LDH活性均有极显著降低，表现出比CPs更好的效果；SeMeCys预处理组细胞培养液中ALT、AST和LDH活性相对模型组均极显著降低；与SeCPs组相比，ALT和AST指标进一步降低，而LDH活性则略高于SeCPs组；SeCPs+SeMeCys组对降低ALT、AST活性是所有组中最有效的，但对于降低LDH活性的效果则稍逊于SeCPs组、SeMeCys组。

表4 不同处理组HepG2细胞培养液中ALT、AST、LDH活性

2.8 玉米肽及硒代氨基酸对H2O2损伤HepG2细胞中SOD和GSH的影响

由表5可知，经过2.5 h H2O2处理后，模型组HepG2细胞中SOD活性和GSH含量均极显著低于空白对照组。经过CPs处理后细胞中SOD活性和GSH含量相较于模型组显著升高(P<0.05)；相比于CPs组，SeCPs预处理的细胞内的SOD活性进一步升高，而GSH含量相对于模型组产生极显著差异；SeMeCys预处理对细胞SOD活性和GSH含量均有极显著提高作用，其中GSH含量相对于SeCPs组有大幅提升，接近空白对照组水平；SeCPs+SeMeCys组中SOD活性相比SeMeCys组进一步提高，GSH含量与SeMeCys组相当。所有给药预处理组相对模型组均存在一定差异，从SOD和GSH指标来看，抗氧化效果最好的是SeMeCys组和SeCPs+SeMeCys组。

表5 不同处理组HepG2细胞中SOD活性和GSH含量

3 讨论

白藜芦醇是一种良好的自由基清除剂，可抑制自由基链式反应[13]; 还能激活体内抗氧化酶，间接提升机体抗氧化能力[14]。故本研究选用白藜芦醇作为老龄小鼠组模型的阳性对照，比较SeCPs的抗氧化活性。CPs有一定的抗氧化效果，但相较于SeCPs还存在较大差异，说明硒在抗氧化中发挥了至关重要的作用。在老龄鼠模型中，当灌胃SeCPs组、SeMeCys组、SeCPs+SeMeCys组含等量的硒时(表1)，均对GSH-Px活性提升有极好的效果，这可能与硒在GSH-Px中发挥的重要作用有关；对于SOD和MDA指标这3组间存在一定差异，单独灌胃SeMeCys组的老龄鼠SOD活性提升不明显，而SeCPs组则对上述2个指标均有明显改善作用，这说明除了硒的作用外，肽对抗氧化作用亦有一定贡献。综合来看，抗氧化效果最好的是SeCPs组。

H2O2是生物体中氧化代谢的中间产物，在细胞处于氧化应激状态时很容易进入细胞内造成损害[15]。H2O2能在短时间内被肝细胞中的铁转化成·OH，从而对蛋白、核酸等大分子造成损伤[16]。因此选用H2O2建立细胞损伤模型。首先通过MTT方法筛选了玉米肽及SeMeCys的最佳剂量，结果显示当CPs和SeCPs在500 μg/mL剂量时均对细胞氧化损伤具有一定保护作用，且SeCPs的效果显著优于CPs(P<0.05)。当SeMeCys浓度为0.01 μg/mL(其硒含量与本试验的SeCPs相当)时，对细胞的氧化损伤有显著的保护作用(P<0.05)，若当其剂量进一步提高至0.1 μg/mL以上时，其抗氧化效果达到极显著水平(P<0.01)。为了更好地研究硒在抗氧化方面发挥的作用，本试验选用抗氧化活性最高的剂量1 μg/mL进行后续研究。流式细胞术结果表明，经过H2O2处理后损伤的HepG2细胞大部分为凋亡晚期或坏死细胞，说明即使移除H2O2后，也无法逆转细胞的损伤；而加入不同的剂量SeCPHs进行预处理后，对其毒性有所抑制，这一结果与MTT试验基本一致。

对培养液及细胞内生化指标的测定结果表明，SeCPs组在各指标上总体优于CPs，这与动物模型结果基本一致；SeMeCys 组由于采用了较高的(硒)剂量，除LDH指标与SeCPs组相当外，其他各项抗氧化指标均优于SeCPs组；SeCPs+SeMeCys组采用SeCPs和SeMeCys按1∶1(V∶V)混合后浓度各自减半，此时SeCPs、SeMeCys和SeCPs+SeMeCys组硒含量分别为0.005、0.5、0.25 μg/mL，但SeCPs+SeMeCys组各生化指标整体与SeMeCys组相当，由于SeCPs即SeCPHs是由含硒玉米肽、不含硒玉米肽以及少量氨基酸组成的，提示当高含硒量(0.25 μg/mL)的含硒氨基酸与硒含量低100倍的玉米肽(0.002 5 μg/mL)组合时，高含硒量化合物与玉米肽间具有协同抗氧化作用。

4 结论

采用CPs(400 mg/kg)、SeCPs(400 mg/kg)以及硒含量相等的SeMeCys(10 μg/kg)、SeCPs (200 mg/kg)+SeMeCys(5 μg/kg)剂量连续灌胃30 d后，老龄小鼠血清中SOD、MDA、GSH-Px、 T-AOC和胸腺指数等指标均得到一定改善，各组中以SeCPs组效果最好，CPs效果相对最差，说明硒对抗氧化有重要贡献，当硒含量相等时，玉米肽比氨基酸效果更好。

经过CPs、SeCPs、SeMeCys、SeCPs+SeMeCys分别预处理的HepG2细胞，对H2O2的氧化损伤具有一定的抵抗作用，其中以SeMeCys效果最好。经过CPs(500 μg/mL)、SeCPs(500 μg/mL)、SeMeCys(1 μg/mL)、SeCPs(250 μg/mL)+SeMeCys(0.5 μg/mL)分别进行预处理后，细胞培养液中的ALT、AST、LDH和细胞中的SOD、GSH指标相较于H2O2模型组均有所改善，其中SeCPs组效果优于CPs组，表明硒在玉米肽抗氧化中发挥了重要作用。

SeMeCys组和SeCPs+SeMeCys组效果相当，说明高含硒量化合物与玉米肽间具有协同抗氧化作用。

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Antioxidant Activity of the Selenium-Riched Corn Protein Hydrolysate

Wang Chi Zhang Jiuliang Yao Yong Nie Suping Hu Jun He Hui

( College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University; Key Laboratory of Environment Correlative Dietology, Ministry of Education, Wuhan 430070)

In order to study the antioxidant activity of the hydrolysate of selenium-riched corn protein, the aged mice and HepG2 cell models were applied to systematiclly research the antioxidant activity of the ordinary corn peptides (CPs), selenium-riched peptides (SeCPs), and Se-methylselenocysteine (MeSeCys). The results showed that after a gavage of SeCPs (400 mg/kg for 30 d), the SOD, MDA, GSH-Px, T-AOC in the serum of aged mice and thymus index were improved significantly or highly significantly, the T-AOC of SeCPs group was 13.38% higher than that of CPs group, which meant selenium made a great contribution to the antioxidant activity, the T-AOC of corn peptides was 15.79% higher than amino acid in the same selenium level. In the HepG2 model, MeSeCys with a high selenium content could significantly improve the viability of HepG2. The ALT, AST in culture fluid and SOD, GSH in cells could be improved highly significantly in the same level by MeSeCys(0.5 μm/mL of selenium content ) and SeCPs+MeSeCys (0.5 μm/mL of selenium content), which suggested the compounds contained high selenium and corn peptides had a synergistic effect.

selenium-riched peptides, se-methylselenocysteine, antioxidant

国家自然科学基金(30972043)，中央高校基本科研业务费专项资金(2013PY095)

2015-07-02

王驰，男，1990年出生，硕士，食品化学

何慧，女，1960年出生，教授，食品化学

Q514

A

1003-0174(2017)02-0049-08