金毅然，马晓娜，马海滨，刘 婷，梁雪云

·论 著·

慢性缺氧对成年小鼠海马区神经发生的影响

金毅然，马晓娜，马海滨，刘 婷，梁雪云

目的 通过观察慢性缺氧对成年小鼠海马区神经发生的影响，探讨脑卒中导致的血管性痴呆的发病机制。方法 利用海马区神经干细胞慢性缺氧模型，通过神经干细胞形态变化观察及直径测量、TUNEL染色和免疫细胞化学染色等方法，评价慢性缺氧对神经干细胞形态、增殖能力、分化能力及凋亡的影响。结果 随着缺氧时间延长，低氧组神经干细胞球结构破坏明显，增长停滞。神经干细胞球直径测量结果显示：正常组与第0天直径(130.30±5.74)μm相比，第3天直径(195.62±20.18)μm、第7天直径(247.43±32.97)μm及第12天直径(298.97±39.59)μm均明显增长(P<0.05)；而低氧组神经干细胞球直径在不同时间点差异均无统计学意义(P>0.05)。TUNEL染色结果发现，缺氧组神经干细胞有明显TUNEL阳性表达。免疫细胞化学染色结果显示：缺氧组中，偶见神经干细胞表达Nestin蛋白，而GFAP蛋白表达明显增强。结论 慢性缺氧影响成年小鼠海马区的神经发生，这可能是脑卒中血管性痴呆的发病机制之一。

慢性缺氧；体外模型；神经发生

随着脑卒中的发病率持续增加，血管性痴呆(VD)可能会成为老年期痴呆的第一大病因[1]。VD是指由脑血管病变引起的或与脑血管病变有关的一种获得性的慢性进行性智力损害综合征[2]。目前VD的发病机制还不清楚，临床缺乏有效的治疗手段。研究已证明，海马DG区的神经发生与人类认知能力相关[3]。关于脑缺血对海马区神经发生的影响及机制目前仍无定论，探明脑缺血对海马区神经发生的影响及机制必将有利于临床VD的治疗。本实验通过建立体外海马区神经干细胞慢性缺氧模型，探讨慢性缺氧对小鼠海马区神经发生的影响。

1 材料与方法

1.1 材料：本实验于2014-2016年在宁夏医科大学总医院宁夏人类干细胞研究所开展。Neurobasal-A 培养基(GIBCO公司)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，Peprotech公司)，(EGF，Peprotech公司)，无血清细胞培养添加剂B27(GIBCO公司)，青链霉素(GIBCO公司)，山羊血清，TritonX-100,Nestin抗体(Santa Cruz公司)，FITC标记的山羊抗小鼠荧光二抗(Santa Cruz公司),NeuroCult Chemical Dissociation Kit (Mouse)(stemcell公司)，Enzymatic Dissociation of Adult Mouse and Rat CNS Tissue(Stemcell 公司)。

1.2 方法

1.2.1 海马区神经干细胞培养：取8周成年C57BL/6小鼠，断颈处死后，无菌条件下取出大脑，仔细剥离海马组织齿状回，DMEM漂洗2次后，尽可能剪碎组织，以上操作均在冰上进行。将剪碎组织移入离心管，加入1 mL Tryple，37 ℃水浴，30 min。消化结束后，1 200 r/,om,离心5 min。弃上清液后，加入Neurobasal-A /B27培养液，充分吹打均匀后，调整细胞数，入培养箱，37 ℃，5% CO2培养。每隔3 d，半量换液1次。

1.2.2 氧-葡萄糖剥夺(OGD)模型：将细胞培养液换为无糖型培养基后，置于低氧(5% O2)处理3、7、12 d，根据细胞生长状态，筛选出适宜的低氧处理时间。

1.2.3 TUNEL染色：按说明书，将细胞换入固定液固定后，加入TUNEL试剂，37 ℃孵育1 h。PBS清洗后，荧光倒置显微镜观察阳性细胞。

1.2.4 免疫细胞化学染色：细胞经固定后，滴加Nestin或GFAP抗体，4 ℃孵育过夜，加入荧光标记的IgG,室温孵育1 h。PBS清洗后，荧光显微镜观察阳性细胞。

1.3 统计学方法：采用SPSS 17.0 统计软件，多组间比较采用单因素方差分析，同一时间点低氧组和正常组比较采用独立样本t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 缺氧对神经干细胞形态变化影响：与正常组相比，低氧组神经干细胞球在3 d后中心阴影明显，结构松散，神经干细胞球增长停滞，在低氧培养12 d后细胞球明显萎缩。分别在培养3、7、12 d测量神经干细胞球直径，随着培养天数的增加，正常组与第0天直径(130.30±5.74)μm相比，第3天直径(195.62±20.18)μm、第7天直径(247.43±32.97)μm及第12天直径(298.97±39.59)μm均明显增长(P<0.05)，见表1。

表1 不同时间点正常组与低氧组神经干细胞球直径测量

注:*与正常组第0天相比，P<0.05；#与同一时间点正常组相比，P<0.05。

2.2 缺氧对神经干细胞增殖能力影响：随着培养天数的增加，正常组神经干细胞球体积增长明显，而低氧组神经干细胞球无明显增长。

2.3 缺氧对神经干细胞凋亡影响：在培养12 d后，2组神经干细胞球染色结果显示，正常组细胞偶有TUNEL阳性细胞(3个±1个/视野)，而低氧组TUNEL阳性细胞数目明显增多(16个±4个/视野)，2组之间差异有统计学意义(P<0.05)。

2.4 缺氧对神经干细胞分化能力影响：在培养12 d后，神经干细胞标志Nestin染色结果显示，正常组细胞Nestin阳性细胞较多，而低氧组Nestin阳性细胞数目明显减少；相反，胶质细胞标志GFAP在正常组表达较少，而在低氧组表达明显较多。

3 讨论

海马齿状回是成人大脑神经干细胞存在的主要脑区之一[4]。在正常情况下，成人海马区齿状回的神经前体细胞增殖转化为成神经细胞，不成熟的成神经细胞移行到齿状回内颗粒细胞层，接着分化为齿状回颗粒细胞，几天内，新生的神经元向分子层伸出突起，把轴突投射到CA3区[5]。研究发现，缺血性脑损伤造成神经元退行性变的同时，也促进了神经再生[6]。神经发生可以替代损伤或者死亡的神经元或胶质细胞。相对于胚胎期神经干细胞，成人神经干细胞的增殖能力较为低下，这和成人脑内神经干细胞的微环境改变有关。脑内微环境改变，直接影响干细胞的分化及迁移路线，进而影响大脑功能[7]。

细胞生存微环境的改变可以导致神经元细胞的凋亡甚至死亡，同时也可能是导致生发中心神经干细胞增殖和分化的重要因素[8-10]。本实验结果显示，随着培养天数的增加，正常组神经干细胞球体积增长明显，而低氧组神经干细胞球无明显增长，说明低氧会抑制神经干细胞的增殖。同时我们发现，正常组神经干细胞偶有TUNEL阳性的凋亡细胞，而低氧组TUNEL阳性的凋亡细胞数目明显增多，说明脑缺血的低氧条件会促进海马区神经干细胞的凋亡。

神经干细胞可以分化为不同类型的胶质细胞及神经元[11]。在痴呆患者大脑中，胶质细胞增生活跃，而神经元变性、坏死[12]。还有研究发现，脑缺血引起的神经发生，大多数神经干细胞增殖分化为胶质细胞，没有或鲜有分化为神经元。本实验结果显示，在培养12 d后，神经干细胞标志NESTIN染色正常组Nestin阳性细胞较多，而低氧组Nestin阳性细胞数目明显减少；相反，胶质细胞标志GFAP在正常组表达较少，而在低氧组表达明显较多。本结果表明，慢性缺氧可以导致小鼠海马区神经干细胞干性降低且具有向胶质细胞分化的倾向。

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The effects of chronic ischemia on hippocampal neurogenesis of adult mice

JIN Yiran,MA Xiaona,MA Haibin,LIU Ting,LIANG Xueyun.

The Ningxia Human Stem Cell Research Institution,General Hospital of Ningxia Medical University,Yinchuan 750004,China

LIANG Xueyun,Email:liangxy2104@hotmail.com

Objective To explore the possible mechanisms of ischemia induced vascular dementia by evaluating the affection of chronic ischemia on hippocampal neurogenesis of adult mice.Methods Chronic ischemia model were setting up in vivo,the morphology of the neurosphere was observed,the proliferation ability of the neurosphere was evaluated by diameter measure;the apoptosis of the neurosphere was test by TUNEL staining;the differentiation ability of the neurosphere was examined by immune-cytostaining.Results Compared with the neurosphere in the normal control group,the neurosphere in the ischemic group seemed stopped to proliferation and its structure was destroyed.The TUNEL positive cell number was more in ischemic group than that in normal control group.The expression of nestin was lower in ischemic group than that in normal control group,but the expression of GFAP was more in ischemic group than that in normal control group.Conclusion Chronic ischemia may has effects on hippocampal neurogenesis of adult mice,which might be one of the mechanisms of ischemia induced vascular dementia.

Chronicischemia;Invivochronicischemiamodel;Neurogenesis

10.13621/j.1001-5949.2017.07.0582

国家自然科学基金项目(81460186)；宁夏自然科学基金项目(NZ 14130)

宁夏医科大学总医院宁夏人类干细胞研究所，宁夏 银川 750004

金毅然(1987-),女，回族，本科，技师，主要从事干细胞研究工作。

梁雪云，Email:liangxy2104@hotmail.com

http://kns.cnki.net/kcms/detail/64.1008.R.20170713.0844.006.html

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2016-12-06 [责任编辑]马兴忠