马建东，殷 刚，李 强

·论 著·

小鼠肉瘤细胞分泌的生长因子对裸鼠坐骨神经损伤修复的探讨

马建东1，殷 刚2，李 强1

目的 探讨小鼠肉瘤细胞S180分泌的神经生长因子(Nerve Growth Factor，NGF)与外源性神经生长因子对损伤坐骨神经的修复效果。方法 将裸鼠分为8组，实验操作后观察其肢体运动恢复情况，采用改良Tarlov评分，取血液标本检测NGF浓度；取脊髓腰膨大处做切片染色，观察受体Trka和p75。结果 小鼠肉瘤细胞S180分泌NGF，且接种量不同，NGF产生量也不同,接种1×104为0.390±0.018，接种1×105为0.445±0.012，接种2×105为0.469±0.017，接种1×106为0.520±0.049，接种2×106为0.571±0.042；接种组神经损伤恢复效果明显优于未接种组；改良评分接种组接种1×104为2.00±0.00，接种1×105为2.25±0.50，接种2×105为2.75±0.50，接种1×106为2.75±0.50，接种2×106为2.50±0.57，均优于其他组；切片显示接种组Trka和P75均表达增高。结论 接种肉瘤细胞S180可产生内源性NGF，内源性NGF对周围神经损伤修复效果优于外源性NGF。

肉瘤细胞S180；神经生长因子；坐骨神经损伤

使用神经生长因子(NGF)治疗周围神经损伤一直是研究的热点，NGF能够促进神经的修复[1-2]。动物实验中有采用外源性NGF及通过构建模型分泌内源性NGF来研究NGF对坐骨神经损伤后的修复效果[3-6]，但实验缺乏内源性NGF与外源性NGF治疗效果的对照研究，给药途径和内源性NGF持续释放也理想，本实验对此进行研究，报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组：SPF级BALB/c-nu小鼠32只，雄性，鼠龄35 d，购于北京华阜康生物科技股份有限公司，由中国医学科学院医学动物研究所提供，合格证号：SCXK(京)2009-0004。将小鼠分为正常组(4只)、吻合组(4只)、注射NGF组(4只)和接种肉瘤细胞组(分为5个肉瘤细胞数量组，每组4只)。

1.2 药品及试剂:S180小鼠肛门肉瘤细胞(购自中科院)，Trka(E492)一抗为兔抗人多克隆抗体，p75为单克隆抗体，以上试剂由美国GBI公司提供，NGF由宁夏泰康元生物科技有限公司提供。

1.3 实验方法

1.3.1 动物模型建立:接种肉瘤细胞组接种S180肉瘤细胞,接种于小鼠背部，细胞数量分别为1×104、1×105、2×105、1×106、2×106/mL，接种后切断坐骨神经，随后显微镜下吻合；注射NGF组切断坐骨神经后吻合，每只注射NGF 30 μg，使用注射用水溶解于2 mL中；吻合组切断坐骨神经，显微镜下吻合，不注射NGF；正常组不采取任何操作。

1.3.2 NGF浓度测定和观察NGF受体:模型建立后5周取小鼠尾静脉血2 μl，按试剂说明行ELISA法测定NGF浓度；其后腹腔麻醉后以甲醛溶液灌注，取脊髓腰膨大处，病变组织包埋在石蜡块里，切片，染色，显微镜下观察NGF受体，胞浆有棕褐色或黄色颗粒或斑片者为NGF受体阳性细胞[7-8]。

1.4 改良Tarlov评分标准:改良Tarlov评分[9]分为0～5分：0分，肢体无力；1分，肢体可见活动，不能负重；2分，肢体活动频繁，不能负重；3分，可以站立但无法行走；4分，肢体可以行走但有障碍；5分，行走正常。

2 结果

2.1 改良Tarlov评分和NGF浓度检测：接种肉瘤细胞各组Tarlov评分和NGF浓度均高于吻合组和注射NGF组(P<0.05)，接种肉瘤细胞各组NGF浓度均高于正常组(P<0.05)，见表1。接种肉瘤细胞组神经生长因子浓度曲线。

表1 不同组改良Tarlov评分和NGF浓度比较

注：#与正常组比较P<0.05；*与注射NGF组比较P<0.05；▲与吻合组比较P<0.05。

2.2 观察Trka和p75数量:脊髓腰膨大处接种肉瘤细胞组Trka受体和p75受体染色均明显高于正常组，说明受体都有增加。

3 讨论

1951年Levi-Montalcini[10-11]发现小鼠肉瘤细胞S180能够刺激鸡胚交感神经节的生长，其后她们将分离纯化得到的物质命名为NGF，通过外源性给予NGF或细胞移植技术内源性给予NGF均能促进神经损伤的恢复，但它们之间的恢复效果没有比较，另外采用的内源性分泌NGF不能逃避宿主的免疫反应，不能准确反映NGF的效果。本实验裸鼠无免疫系统，同时S180可以持续分泌NGF，解决了NGF浓度问题，改良评分结果优于其他方式，说明内源性NGF更能促进神经损伤的修复。

不同浓度NGF对周围神经损伤修复效果有差异[12]，本研究表明，实验接种组间NGF浓度是有差异的，且都高于其他实验组，但接种组之间修复无差异性，说明当NGF浓度达到某一程度后对神经修复的效果就不存在剂量依赖性，高于一定浓度时可以明显促进神经损伤的修复。

接种组较其他组NGF受体Trka和p75均出现上调，Trka为高亲和力受体，p75为低亲和力受体，NGF对神经修复的作用通过对受体的调节来实现。Trka和p75介导了神经细胞的分化增殖凋亡，通过调控神经细胞的生长周期来影响修复，不同受体在NGF浓度下对神经细胞电位的影响不同[18]，实验表明NGF不是通过单一提高某一受体而促进神经修复的。

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The effects of nerve growth factor S180 on repairing sciatic nerve in mice

MA Jiandong1,YIN Gang2,LI Qiang1.

1.The First People’s Hospital of Yinchuan,Yinchuan 750001,China;2.The Emergency Rescue Center of Yinchuan,Yinchuan 750004,China

Objective To study the repair function of nerve growth factor (NGF) which secrete by sarcomas 180 and extrinsic nerve growth factor on sciatic nerve.Methods Rats were randomly divided into eight groups,included five groups,NGF group,normal group and four rats in each group,except normal group.Others were cut sciatic nerve and anastomosed,and observed the hindlimb function,NGF concentration,Trka and p75.Results Sarcomas 180 secreted nerve growth factor,also the concentration of nerve growth factor were different,the rats inoculated group were better recovery than those in other groups.The Trka and p75 which rats inoculated had elevation than those in other groups.Neurotrophin receptors Trka and p75.Conclusion Rats inoculated sarcomas can secrete endogenous nerve growth factor,it has a good effects than extrinsic nerve growth factor.

Nervegrowthfactor;Sciaticinjury;Sarcomas180

10.13621/j.1001-5949.2017.07.0580

1.宁夏银川市第一人民医院，宁夏 银川 750001 2.宁夏银川市紧急救援中心，宁夏 银川 750001

马建东(1978-)，男，硕士学位，主要从事骨科工作。

http://kns.cnki.net/kcms/detail/64.1008.R.20170713.0844.004.html

R746

A

2016-08-31 [责任编辑]马兴忠