王珊++++++杨华昱++++++姚兰++++++汪云超++++++陈海平++++++马清

[摘要] 目的 研究不同程度动脉粥样硬化与miR-21表达量的相关性，以及应用长春西汀后对miR-21表达量的影响。 方法 选取2014年1月～2016年12月于首都医科大学附属北京友谊医院医疗保健中心住院的动脉粥样硬化患者40例，按动脉粥样硬化程度将其分为轻度（9例）、中度（6例）和重度（25例），按治疗方法将其分为用药组（17例）和对照组（23例）。提取患者的血清RNA并利用实时定量PCR方法分析不同程度动脉粥样硬化患者血清中miR-21水平，比较用药组和对照组治疗前后miR-21含量和血细胞比容的变化。 结果 重度动脉粥样硬化患者血清miR-21表达水平明显高于轻度动脉粥样硬化患者，差异有统计学意义（P < 0.05）。治疗后，用药组血细胞比容、miR-21相对含量均较治疗前明显下降，差异有统计学意义（P < 0.05），用药组和对照组治疗后miR-21相对含量比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。 结论 动脉粥样硬化患者血清miR-21水平随动脉粥样硬化程度的增高而增高，经长春西汀治疗后，miR-21表达水平明显下调，提示miR-21与动脉粥样硬化程度相关。

[关键词] 长春西汀；动脉粥样硬化；微小RNA

[中图分类号] R541.4 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）06（c）-0161-04

[Abstract] Objective To study the correlation between different degrees of atherosclerosis and the expression quantity of miR-21， and the influence of Vinpocetine application on the expression quantity of miR-21. Methods Forty patients with atherosclerosis hospitalized in Medical Care Center， Beijing Friendship Hospital， Capital Medical University from January 2014 to December 2016 were selected， and they were divided into mild （9 cases）， moderate （6 cases） and severe （25 cases） according to the degree of atherosclerosis， and they were also divided into medication group （17 cases） and control group （23 cases） according to the treatment method. The serum RNA of patients was extracted and the levels of serum miR-21 in the patients with different degrees of atherosclerosis were analyzed by real-time quantitative PCR， the changes of miR-21 and haematocrit before and after treatment in the medication group and control group were compared. Results The expression of miR-21 in patients with severe atherosclerosis was higher than that in patients with mild atherosclerosis， the difference was statistically significant （P < 0.05）. After treatment， the haematocrit and relative contents of miR-21 in the medication group were lower than those before treatment， the differences were statistically significant （P < 0.05）， there was no statistically significant difference of the relative contents of miR-21 after treatment between medication group and control group （P > 0.05）. Conclusion The levels of serum miR-21 in patients with atherosclerosis are increased with the increase of atherosclerosis， and the expression of miR-21 is significantly decreased after treatment with Vinpocetine， which indicates that miR-21 has correlation with atherosclerosis.

[Key words] Vincristine； Atherosclerosis； MicroRNA

動脉粥样硬化以动脉壁的脂质沉积、功能紊乱及斑块形成、慢性炎症细胞浸润为主要特征，是公认的一种慢性炎症疾病[1]，其预防与治疗是目前心脑血管专家关注的焦点之一[2]。miR-21是一类非编码RNA，其作为原癌基因在多种肿瘤中高表达，并参与细胞的增生、分化、凋亡等过程，在肿瘤的发生发展中具有重要作用[3]。而近期有研究表明，miR-21在脑梗死、冠心病等动脉粥样硬化相关性疾病中表达明显增高[4-5]。长春西汀具有抑制血小板聚集、降低血液黏度、改善血液微循环和流动性等作用[6-8]，且可改善大动脉粥样硬化。本研究着眼于明确动脉粥样硬化程度与miR-21含量之间的关系，以及应用长春西汀后对miR-21表达量的影响，为研究miR-21表达水平对动脉粥样硬化程度的评估和发生发展机制研究提供理论支持。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2014年1月～2016年12月于首都医科大学附属北京友谊医院医疗保健中心住院的动脉粥样硬化患者40例。研究对象均在住院期间接受脑血流图以及颈动脉、锁骨下动脉、双下肢动脉B超检查，存在1条或1条以上动脉粥样硬化的患者即纳入研究对象。按照所累积的血管数量将动脉粥样硬化程度分为轻度（9例）、中度（6例）和重度（25例），轻度是指存在2条或2条以下大动脉粥样硬化，中度是指存在3～4条大动脉粥样硬化，重度是指存在4条以上大动脉粥样硬化，或有冠心病、下肢动脉闭塞。排除标准：患有重大疾病，比如恶性肿瘤、严重心脑血管疾病、需要进行重大器官移植手术、深度昏迷、永久性瘫痪、严重脑损伤等；体检项目（包括肝肾功能、血常规、腹部B超、胸部X线片等）中提示肝肾功能不全等异常的患者。按照治疗方法的不同将患者分为对照组（23例）和用药组（17例），两组一般资料比较差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。见表1。

1.2 治疗方法

对照组给予阿司匹林，100 mg/次，1次/d，口服。用药组在对照组的基础上增加长春西汀注射液（匈牙利吉瑞大药厂，10 mg/支，批号A9A017B），首剂量为20 mg/次，1次/d，第2天开始为30 mg/次，1次/d，均加入0.9%氯化钠注射液250 mL，静脉滴注。两组患者均治疗14 d。治疗前后均用EDTA采血器抽取5 mL静脉血，收集血清，分装于EP管保存于-80℃冰箱中。

1.3 主要仪器与试剂

实时定量PCR仪型号为ABI 7500。RNA提取所用TRIzol购自Invitrogen公司；mRNA逆转录试剂盒购自Transgene公司；天根公司的miRcute Plus miRNA定量PCR检测试剂盒（SYBR Green）（货号：FP411）；miR-21及对照的引物序列购买自Invitrogen公司，序列见表2，其中U6为对照。

1.4 血清RNA的提取与实时定量PCR检测

1.4.1 RNA提取 从-80℃冰箱中取出血清样本，冰上溶解后，提取300 μL加入1 mL TRIzol，室温放置5 min。之后加入0.2 mL三氯甲烷震荡30 s，室温1 min。将样品于4℃离心机中，12 000 r/min离心30 min。吸取上层水相加入等体积异丙醇，混匀后于-20℃沉淀10 h。之后4℃，12 000 r/min，离心30 min。弃掉上清，用1 mL 75%的预冷乙醇洗沉淀2次，弃掉上清后将EP管置于室温使残留的乙醇挥发，使沉淀干燥。加入适量的DEPC水（30～40 μL）溶解沉淀，取适量RNA进行琼脂糖电泳观察条带，并用分光光度仪测RNA浓度。

1.4.2 逆转录过程 使用Transgene公司EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix试剂盒，按照说明书进行操作。逆转录体系如下：RNA 500 ng～2 μg，2×TS缓冲液10 μL，TSII缓冲液1 μL，OligodT试剂1 μL，无核酸酶水补至20 μL。运行RT程序：42℃，30 min；85℃，5 min；4℃，10 min。

1.4.3 实时定量PCR反应 使用Takara公司的SYBR预混试剂及ABI7500定量PCR仪进行定量PCR，以人snRNA U6（Human snRNA U6）为内参。实时定量PCR反应体系：PCR预混试剂10 μL，RT模板1 μL，引物（上下游各10 μmol/L）1 μL，50×ROX DYE Ⅱ 0.4 μL，无菌去离子水7.6 μL。程序如下：95℃预变性10 s；95℃变性5 s，60℃退火延伸34 s，重复40个循环，然后进行溶解曲线分析。采用相对定量方法对实时定量PCR的結果进行分析。

1.5 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组计量资料比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，两组计量资料比较采用t检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同程度动脉粥样硬化患者基线资料与miR-21含量比较

重度动脉粥样硬化患者动脉粥样硬化指数（AI）、血细胞比容、miR-21相对含量均明显高于轻度动脉粥样硬化患者（P < 0.05），而高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）则明显低于轻度动脉粥样硬化患者，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见表3。

2.2 对照组和用药组治疗前后血细胞比容和miR-21相对含量的变化比较

治疗前对照组和用药组血细胞比容以及miR-21相对含量比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。治疗后，用药组血细胞比容、miR-21相对含量均较治疗前明显下降（P < 0.05），对照组组内治疗前后血细胞比容、miR-21相对含量比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。治疗后，对照组和用药组血细胞比容以及miR-21相对含量比较，差异亦无统计学意义（P > 0.05）。见表4。

3 讨论

随着老龄化社会进程的加快，我国动脉粥样硬化的发病率呈逐渐上升趋势[9]，同时，由于动脉粥样硬化是心脑血管突发事件的主要原因，因此对动脉粥样硬化的程度进行详细评估、针对性治疗和疗效评估意义重大，其可大大降低动脉粥样硬化疾病和心脑血管突发事件的发病率[10]。研究表明[11-12]，动脉粥样硬化形成机制主要包括脂质浸润、氧化应激、慢性炎性反应与损伤、血小板聚集以及血栓形成等，其中血管内皮损伤是动脉粥样硬化发生发展的中心环节[13]。

microRNA在动脉粥样硬化的发生、发展过程中起到重要的调控作用，其中miRNA对内皮细胞的调节以及与血管内皮损伤之间的关系成为研究热点之一[14-15]。研究发现[16]，miR-21通过激活NO产生的通路影响血管内皮细胞的生物学功能，从而调控血管的损伤修复与新生。同时microRNA在各种因素造成的血管内皮损伤中，可调节血管活性物质和细胞因子水平[如肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白介素（IL）等]，从而调控炎性反应的程度及损伤程度[17-18]。研究发现，miR-21表达上调可导致白细胞增加及NF-κB表达上调，促使TNF-α、IL-6、IL-8等炎性因子的释放，从而通过影响机体炎性反应影响动脉粥样硬化形成[19-20]。

本研究发现根据动脉粥样硬化程度进行轻度、中度、重度分类后，通过分析研究对象的基线资料，发现反映血液黏稠度的血细胞比容与AI、HDL-C水平，均与动脉粥样硬化程度有明显相关性，血细胞比容水平越高，则动脉粥样硬化程度越重，而HDL-C水平越高时动脉粥样硬化程度越轻。通过实时定量PCR检测miR-21含量后发现，miR-21的相对含量与动脉粥样硬化程度呈正相关，差异有统计学意义（P < 0.05），说明miR-21水平、血细胞比容、AI、HDL-C水平可反映动脉粥样硬化的程度。之后，本研究应用长春西汀治疗动脉粥样硬化后发现，规范应用长春西汀14 d后患者的血细胞比容明显下降，miR-21相对含量的变化与血细胞比容相同，说明长春西汀具有改善血液黏稠度的效果，同时能降低miR-21的含量以及血细胞比容，其结果说明长春西汀可影响动脉粥样硬化的程度，具有改善动脉粥样硬化的疗效。

综上所述，动脉粥样硬化患者血清miR-21可作为判断动脉粥样硬化程度的一种血液标志物，同时能部分反映动脉粥样硬化治疗后的效果。但本研究样本量偏小，且为单中心实验，同时关于miR-21对动脉粥样硬化的作用机制未进行深入探索，故待下一步扩大样品量以及于细胞水平、分子水平进行实验进一步验证。总之，本研究发现动脉粥样硬化患者血清miR-21水平与动脉粥样硬化程度呈正相关，且经长春西汀治疗后miR-21表达水平明显下调，说明miR-21具有一定的疗效评估作用以及臨床诊断价值。

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