陈少阳++++++岳宏林++++++刘旭

[摘要] 目的 探讨紫铆因（Butein）诱导人食管癌EC109细胞凋亡的作用及AMP依赖的蛋白激酶（AMPK）/叉头转录因子O3a（FOXO3a）信号通路、氧化应激在该过程中发挥的作用。 方法 常规培养EC109细胞，分别给予Butein处理，首先检测EC109细胞的活力、迁移能力、氧化应激水平及凋亡指标Caspase 3的活性。采用Western blot法检测细胞内AMPK、FOXO3a的磷酸化水平及凋亡调节蛋白Bim、Bcl2相关X蛋白（Bax）的表达水平。用Compound C阻断AMPK后检测相关指标。建立裸鼠皮下肿瘤模型，给予Butein和Compound C处理，检测裸鼠体重和肿瘤体积。 结果 Butein处理后，细胞活力下降（P < 0.05）；细胞间距增加（P < 0.05）；Caspase 3活性、NADPH氧化酶活性、ROS含量升高（P < 0.05）；总GSH下降，提示凋亡增加、氧化应激增强；p-AMPK磷酸化水平、p-FOXO3a磷酸化水平升高（P < 0.05）；Bim、Bax表达升高（P < 0.05）；Compound C处理逆转了这一过程。裸鼠皮下肿瘤检测发现Butein抑制在体肿瘤增殖，阻断AMPK可以逆转该抑制作用。 结论 Butein能显著促进食管癌EC109细胞凋亡。该作用可能是通过激活AMPK/FOXO3a信号通路来实现的。

[关键词] 紫铆因；食管癌；AMP依赖的蛋白激酶；叉头蛋白转录因子O3a；氧化应激；凋亡

[中图分类号] R735.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）06（c）-0025-05

[Abstract] Objective To investigate the effects of Butein on esophagus cancer EC109 cells and the role of AMP-activated protein kinase （AMPK）/forkhead class box O3a （FOXO3a） and oxidative stress in this process. Methods EC109 cell was routine cultured and given Butein， the cell vitality， migration ability， cellular oxidative stress level of EC109 cell and Caspase 3 activity were detected. The AMPK， FOXO3 aphosphorylation level and the expressions of Bim and Bax were detected by Western blot. After Compound C inhibit AMPK， related indicators were detected. The nude mice tumor bearing model was made， Butein and Compound C were given， the weight and tumor volume of nude mice were detected. Results After Butein treatment， cell vitality reduced， the distance between cell boundaries increased， ROS concentration and NADPH oxidase activity increased， total GSH level and Caspase 3 activity reduced （P < 0.05）； AMPKand FOXO3 aphosphorylation and cell apoptosis increased （P < 0.05）； Compound C treatment reversed this process. The nude mice tumor study showed that Butein inhibited the tumor growth and Compound C reversed this effect. Conclusion Butein can induce EC109 cell apoptosis， and this process may be mediated by activation of AMPK/FOXO3a and cellular oxidative stress.

[Key words] Butein； Esophagus cancer； AMP-activated protein kinase； Forkhead class box O3a； oxidative stress； Apoptosis

食管癌是消化系统的常见肿瘤，由于环境、饮食习惯等的差异，世界范围内食管癌发病率差异很大[1]。我国食管癌高发，每年有近15万人死于食管癌[2]。多数患者因吞咽困难就医，然而此时肿瘤多已发生转移，失去手术根治机会。因此食管癌的治疗需要新的治疗策略[3]。目前，祖国传统医学中药材提取物的抗癌作用已成为研究热点[4]，紫铆因（3，4，2'，4'-四羟基查尔酮，Butein）是漆树等植物来源的多酚类化合物。研究证实Butein对包括乳腺癌、肺癌、膀胱癌等多種肿瘤具有抑制和杀伤作用[5-7]，但Butein抗食管癌作用及机制尚不明确。AMP依赖的蛋白激酶（AMPK）是生物能量代谢调节的关键分子，也是肿瘤生物学调控的核心分子，研究表明Butein对AMPK有明确的调控作用[8]。叉头转录因子O3a（forkhead class box O3a，FOXO3a）是叉头转录因子家族成员，在肿瘤细胞中介导多种促凋亡因子转录[9-13]。AMPK可调控FOXO3a的磷酸化水平[14-15]。本研究通过Butein作用于食管癌EC109细胞系，证实AMPK/FOXO3a信号通路是否介导Butein的抗食管癌作用。

1 材料和方法

1.1 实验材料

人食管癌EC109细胞系购自中科院上海细胞库。Butein、Compound C购自Sigma-Aldrich公司（美国）；抗p-FOXO3a抗体、抗FOXO3a抗体、抗Bim、抗Bax抗体购自Abcam公司（美国）；抗p-AMPK抗体、抗AMPK抗体购自cell signaling technology公司（美国）。裸鼠购自中国医学科学院实验动物中心，合格证号：SYXK（京）2013-0019。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及细胞处理 食管癌EC109细胞在完全培养基中常规培养，并置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中。置于37℃细胞培养箱中贴壁24 h，待细胞密度达到80%左右时换成无血清培养基处理12 h，然后给予相应处理。

1.2.2 细胞活力检测 以每孔1×105的密度接种到96孔板。将细胞分为Control组、25 μmol/L But组、50 μmol/L But组。给予相应处理，CCK法检测细胞活力。Butein的浓度和处理时间参考其他肿瘤中Butein相关研究及前期预实验结果，50 μmol/L Butein对食管癌EC109细胞具有较为显著的杀伤作用[16]。

1.2.3 细胞迁移能力检测 在6孔板背面用Marker笔划3条横线，在孔内用200 μL的枪头划线。洗去漂浮细胞，继续培养常规培养，24 h后测量细胞边缘间距并记录。

1.2.4 檢测ROS、总GSH含量和NADPH氧化酶含量及细胞Caspase 3活性

1.2.4.1 ROS检测 向上清加入DCFH-DA探针，37℃孵育1 h，消化离心重悬后检测细胞荧光强度。

1.2.4.2 GSH检测 取50 μL细胞培养上清，加入400 μL试剂一，50 μL试剂二，混匀后于室温静置2 min，加入200 μL试剂三，30 s时检测412 nm波长下的吸光度，为A1，静置5 min后再次检测，为A2，计算出总GSH含量。

1.2.4.3 NADPH氧化酶检测 制备蛋白上清液，首先测定背景对照，进而检测样品总活性，最后检测样品非特异性活性计算可得NADPH氧化酶活性。

1.2.4.4 Caspase 3活性检测 制备蛋白上清，取50 μL细胞裂解上清，加入50 μL 2×反应液，加入0.5 μL的DTT，加入5 μL Ac-DEVD-pNA，37℃孵育4 h后，于405 nm波长下检测吸光度值。

1.3 Western blot

检测p-AMPK、AMPK、p-FOXO3a、FOXO3a、Bim、Bax等蛋白的表达情况，所用抗体及浓度：p-AMPK、AMPK、p-FOXO3a、FOXO3a、Bim、Bax（1∶1500）、β-actin（1∶2000）。

1.4 裸鼠皮下肿瘤的建立及药物处理

取对数期的EC109细胞，在每只裸鼠肩部皮下注射0.2 mL细胞液（1×107个肿瘤细胞），每天腹腔注射PBS、5 mg/kg Butein、5 mg/kg Butein+1 mg/kg Compound C。每3天称重，测量肿瘤体积。第27天处死小鼠并收集肿瘤。

1.5 统计学方法

采用统计软件SPSS 13.0对数据进行分析，正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Butein对食管癌细胞EC109细胞系的影响

CCK8染色结果显示Butein处理后细胞活力显著下降，与Control组相比，活力值分别下降到（70.3±4.6）%、（38.5±4.8）%，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图1。

2.2 Butein对食管癌EC109细胞迁移能力的影响

Butein处理，24 h后检测发现细胞间隙显著增大，Butein处理组细胞间距增加到Control组的（144.0±8.4）%、（208.0±10.6）%，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图2。

2.3 Butein对凋亡相关蛋白Caspase 3活性和氧化应激指标NADPH氧化酶活性、活性氧自由基含量、总GSH含量的影响

25 μmol/L的Butein、50 μmol/L的Butein处理24 h后，与Control组相比，Caspase 3活性、NADPH氧化酶活性、ROS含量均升高；总GSH下降。提示凋亡增加、氧化应激增强，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图3。

2.4 Western blot检测Butein处理后细胞内AMPK、FOXO3a磷酸化水平变化

25 μmol/L的Butein、50 μmol/L的Butein处理后，p-AMPK磷酸化水平升高；p-FOXO3a磷酸化水平升高；Bim、Bax表达升高；差异有统计学意义（P < 0.05）。见图4。提示Butein处理后AMPK和FOXO3a激活，凋亡增强。

2.5 Compound C抑制AMPK对Butein诱导的FOXO3a激活和细胞凋亡的影响

Compound C是AMPK分子的特异性阻断剂，将细胞分为Control组、50 μmol/L的Butein处理组、50 μmol/L的Butein+5 μmol/L Compound C处理组。发现FOXO3a磷酸化水平分别为Control组的（248.0±16.4）%、（176.0±16.4）%；Bim分别为Control组的（182.5±14.3）%、（142.8±10.2）%；Bax分别为Control组的（251.2±19.1）%、（198.2±12.5）%；差异有统计学意义（P < 0.05）。见图5。提示Compound C处理一定程度上逆转了Butein的抗EC109作用。

2.6 Butein及Compound C联合处理对裸鼠在体肿瘤的影响

三组裸鼠体重差异无统计学意义（P > 0.05）。肿瘤体积分别为（915±39）、（440±34）、（581±38）mm3，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图6。可见Butein腹腔注射显著降低了裸鼠皮下肿瘤色生长速度，而AMPK活性抑制剂Compound C处理后一定程度上逆转了Butein的抗肿瘤作用。

3 讨论

本研究體外实验证实，Butein处理显著抑制了EC109细胞增殖和迁移能力。氧化应激指标和凋亡指标检测发现，Butein处理显著激活了EC109细胞氧化应激，表现为GSH含量下降、ROS含量增加以及NADPH活性增强。凋亡检测发现Butein处理上调了Caspase 3的活性、上调了凋亡相关蛋白Bim、Bax的表达。

AMPK在肿瘤发生、增殖、转移等过程中扮演重要角色[17-18]。流行病学研究发现，AMPK下调与肿瘤发生关系密切，亦有研究发现，激活AMPK可以显著抑制肿瘤细胞增殖，诱导其凋亡[19-20]。上述证据提示AMPK可能是肿瘤进展中的关键分子，调控其表达、活性可能是肿瘤治疗的手段之一。本研究重点关注了Butein处理后AMPK的磷酸化水平。本研究给予EC109细胞梯度浓度的Butein处理后，发现AMPK的磷酸化水平剂量依赖地上调。FOXO3a是叉头转录因子家族的成员，能介导多种促凋亡因子的转录。同时FOXO3a又是AMPK的磷酸化底物，本研究检测了FOXO3a的磷酸化水平，发现Butein激活AMPK的同时，上调了FOXO3a的磷酸化水平。为了进一步明确AMPK在该过程中对FOXO3a的调控作用，本研究给予AMPK阻断剂Compound C处理，发现抑制AMPK活性后，FOXO3a的磷酸化水平降低，Butein对细胞活性的抑制能力减弱。为了进一步验证Butein的抗食管癌作用及AMPK/FOXO3a在其中发挥的作用，本研究建立了裸鼠皮下肿瘤模型，给予Butein和Compound C处理，发现Butein处理显著降低了皮下肿瘤体积，而Butein联合Compound C处理后肿瘤体积增大，提示抑制AMPK拮抗了Butein的抗肿瘤作用。

以上证据从离体、在体水平，以及正反两个角度证实，Butein能显著抑制食管癌EC109细胞的增殖、迁移能力，激活氧化应激，促进细胞凋亡。该作用可能是通过激活AMPK/FOXO3a信号通路来实现的。本研究进一步明确了Butein的抗食管癌作用，为进一步开发基于Butein的抗食管癌药物及治疗策略提供了理论参考。

[参考文献]

[1] Gould JC，Wendling MR，Oeschlager BK，et al. Advances in the diagnosis and treatment of barrett's esophagus and early esophageal cancer； summary of the Kelly and carlos pellegrini SSAT/SAGES luncheon symposium [J]. J Gastrointest Surg， 2017. doi： 10.1007/s11605-017-3390-5. [Epub ahead of print]

[2] Ke L. Mortality and incidence trends from esophagus cancer in selected geographic areas of China circa 1970-90 [J]. Int J Cancer，2002，102（3）：271-274.

[3] Wang FR，Fang QQ，Tang WM，et al. Nested case-control study of occupational radiation exposure and breast and esophagus cancer risk among medical diagnostic x ray workers in Jiangsu of China[J]. Asian Pac J Cancer Prev，2015，16（11）：4699-4704.

[4] Padmavathi G，Rathnakaram SR，Monisha J，et al. Potential of butein，a tetrahydroxychalcone to obliterate cancer [J]. Phytomedicine，2015，22（13）：1163-1171.

[5] Bai X，Ma Y，Zhang G. Butein suppresses cervical cancer growth through the PI3K/AKT/mTOR pathway [J]. Oncol Rep，2015，33（6）：3085-3092.

[6] Cho SG，Woo SM，Ko SG. Butein suppresses breast cancer growth by reducing a production of intracellular reactive oxygen species [J]. J Exp Clin Cancer Res，2014，33：51.

[7] Jung SK，Lee MH，Lim DY，et al. Butein，a novel dual inhibitor of MET and EGFR，overcomes gefitinib-resistant lung cancer growth [J]. Mol Carcinog，2015，54（4）：322-331.

[8] Wang Z，Wang N，Liu P，et al. AMPK and Cancer [J]. EXS，2016，107：203-226.

[9] Zhou C，Gu J，Zhang G，et al. AMPK-autophagy inhibition sensitizes icaritin-induced anti-colorectal cancer cell activity [J]. Oncotarget，2017，8（9）：14736-14747.

[10] 張志强，杨艳荣，李运霞.肺癌组织及其肺癌干细胞中FOXO3的表达及意义[J].临床与实验病理学杂志，2015， 31（8）：880-884.

[11] Banskota S，Regmi SC，Kim JA. NOX1 to NOX2 switch deactivates AMPK and induces invasive phenotype in colon cancer cells through overexpression of MMP-7 [J]. Mol Cancer，2015，14：123.

[12] 刘鑫，胡皆乐，李佑，等.FOXO3在结直肠癌组织中的表达及临床意义[J].实用癌症杂志，2016，31（11）：1773-1777.

[13] Chaube B，Bhat MK. AMPK，a key regulator of metabolic/energy homeostasis and mitochondrial biogenesis in cancer cells [J]. Cell Death Dis，2016，7：e2044.

[14] Davila D，Connolly NM，Bonner H，et al. Two-step activation of FOXO3 by AMPK generates a coherent feed-forward loop determining excitotoxic cell fate [J]. Cell Death Differ，2012，19（10）：1677-1688.

[15] Li XN，Song J，Zhang L，et al. Activation of the AMPK-FOXO3 pathway reduces fatty acid-induced increase in intracellular reactive oxygen species by upregulating thioredoxin [J]. Diabetes，2009，58（10）：2246-2257.

[16] Tang YL，Huang LB，Lin WH，et al. Butein inhibits cell proliferation and induces cell cycle arrest in acute lymphoblastic leukemia via FOXO3a/p27kip1 pathway [J]. Oncotarget，2016，7（14）：18651-18664.

[17] 江绍钦，李梦强，王玉兵，等.HIF-1α和AMPK在前列腺癌中的表达及临床意义[J].现代泌尿外科杂志，2016， 21（2）：104-107.

[18] 熊延路，王明星，卢强，等.AMPK在非小细胞肺癌发生发展中的研究进展[J].现代生物医学进展，2014，14（34）：6769-6772.

[19] 崔文贤，许柯青，李元国，等.腺苷酸活化蛋白激酶增强乳腺癌对多柔比星化疗敏感性的机制[J].中国癌症杂志，2016，26（11）：908-915.

[20] 易光明，冯艺兰，黄建鸣，等.AMPK在肿瘤放射治疗中的作用[J].肿瘤预防与治疗，2016，29（1）：44-48.