朱大恒，刘丽，喻锐，赵冉冉，朱利利，程方，刘雨松，吴诗佳，张莉，席宇*

（1.郑州大学生命科学学院，河南郑州450000；2.河南工业大学生物工程学院，河南郑州450002）

芽孢杆菌LWM1的分离鉴定及其对蜡样芽孢杆菌的抑制作用

朱大恒1，刘丽1，喻锐1，赵冉冉1，朱利利1，程方1，刘雨松1，吴诗佳1，张莉2，席宇1*

（1.郑州大学生命科学学院，河南郑州450000；2.河南工业大学生物工程学院，河南郑州450002）

从土壤样品中分离出10株芽孢杆菌（Bacillusspp.），以蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）为指示菌株，采用牛津杯扩散法筛选出一株具有较强抑菌活性的菌株LWM1。综合形态学、生理生化试验、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）及16S rDNA基因序列同源性分析，菌株LWM1被初步鉴定为一株解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），并研究了其在马铃薯葡萄糖水（PDW）和营养肉汤培养基（NB）中发酵上清液对蜡样芽孢杆菌的抑制效果。结果表明，PDW培养基更有利于菌株LWM1生长和抑菌物质产生。因此，可利用PDW培养基为主要底物大规模发酵制备菌株LWM1的抑菌物质。

芽孢杆菌；分离；鉴定；抑菌活性

蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）是环境中常见的食源性致病菌之一[1]，在食品的生产加工过程中被引入到人体[2-4]，部分菌株可通过产生呕吐毒素、溶血素和肠毒素等物质危害人体健康[5-8]。食品加工过程中蜡样芽孢杆菌极易通过形成生物膜而提高其粘附能力和抵抗力[9-10]，同时生物膜也可为其他有害微生物提供良好的定殖场所，导致设备不易清洗，污染的菌体不易清除，进而产生潜在食品安全问题[10]。鉴于芽孢具有较强抵抗力，采用理化方法防控蜡样芽孢杆菌的危害时，操作繁琐，成本较高[11]，因此研究开发高效针对蜡样芽孢杆菌的抑菌剂对保障食品质量安全和人类健康具有重要意义[12]。目前，利用植物源抑菌剂植物提取物[13-14]和植物精油[15-17]抑制蜡样芽孢杆菌的研究较多，而微生物源抗菌剂仅有少量利用乳酸菌抑制蜡样芽孢杆菌或去除其毒素[18-19]的报道，利用芽孢杆菌的研究开发甚少[20]。芽孢杆菌能产生多种高效抑菌物质，目前芽孢杆菌的多个菌株已被成功开发为生物杀菌剂[21]。而且，作为一种理想的胞外分泌型微生物，芽孢杆菌发酵产物中抑菌物质更有利于提取和纯化。因此，选育高抑菌性能的芽孢杆菌菌株已成为当前生物杀菌剂领域的研发热点。

本研究对从土壤中筛选的一株对蜡样芽孢杆菌抑菌活性较高的菌株，通过形态学、生理生化试验、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）及16SrDNA基因序列同源性分析对分离菌株进行了鉴定，并初步研究了分离菌株发酵上清液对蜡样芽孢杆菌的抑制作用，旨在为开发绿色环保抗菌剂提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种及培养基

蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）（菌株编号为ATCC11778）：由河南省疾病预防控制中心提供，菌种保藏于营养琼脂（nutrient agar，NA）斜面培养基。营养琼脂培养基（NA）、营养肉汤培养基（nutrient broth，NB）和芽孢染色试剂盒：北京陆桥技术有限责任公司；马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextroseagar，PDA）和马铃薯葡萄糖水（potatoglucosewater，PDW）：青岛海博生物技术有限公司。

1.1.2 土壤样品及试剂

土壤样品：2016年7月6日采集于河南省兰考县夏武营绿色蔬菜基地，用于拮抗芽孢杆菌的分离。氯化钠（分析纯）：北京昊迪精细化工制品有限公司；芽孢染色液（160413）：北京路桥技术股份有限公司。

1.2 仪器与设备

HZQ-X100恒温振荡培养箱：太仓市实验设备厂；GHP-9160隔水式恒温培养箱：上海一恒科技有限公司；Avanti J-25低温高速离心机：美国Beckmancoulter公司；BS223S电子分析天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司；EclipseE200生物显微镜：尼康仪器（上海）有限公司；UV-1700（E）分光光度计：日本岛津公司；SYQ-DSX-280B手提式高压蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂；Uhrafle Xtreme基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（MALDI-TOF MS）：德国布鲁克公司；牛津杯（内径（6.0±0.1）mm，外径（7.8±0.1）mm，高（10.0±0.1）mm）：青岛海博生物技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 芽孢杆菌的分离纯化

将采集的蔬菜根际土样5 g无菌操作加入至含95 mL带玻璃珠的无菌生理盐水的锥形瓶中，37℃、180 r/min振荡20 min，75℃水浴20 min，静置5 min后取土壤菌悬液进行梯度稀释，稀释液涂布于NA平板，设置3个平行，45℃培养1～3 d，定期观察，选取优势单菌落划线纯化并斜面保存备用。

1.3.2 蜡样芽孢杆菌拮抗菌株的筛选

将筛选的菌株接种到NB培养基中37℃、150 r/min培养24 h后，于12 000 r/min、4℃离心10 min，经0.22 μm无菌滤膜过滤获得上清液，上清液抑菌活性检测采用文献[22]的牛津杯双层平板扩散法进行，略有改动：无菌培养皿中加入10 mL琼脂含量为1.5%的水琼脂，凝固后放入牛津杯，同时取NB培养基中过夜培养的蜡样芽孢杆菌菌液1.5 mL（OD600nm值为1.5）接种至45℃、100 mL的NA培养基中混合均匀后，迅速取20 mL加入至培养皿中，凝固后取出牛津杯，以NB培养基为对照，在牛津杯小孔中分别加入150 μL分离菌株上清液，于4℃冰箱中静置4h，37℃培养6～8h后，测量抑菌圈直径（diameter of inhibition zone，DIZ），试验设置3个平行，结果取平均值。

1.3.3 拮抗菌株的鉴定

形态观察：将分离菌株分别接种到NA和PDA平板上，37℃培养24 h，观察菌落特征；挑取菌落边缘菌体用芽孢染色试剂盒进行染色，显微镜镜检并拍照。

生理生化特征：分离菌株生理生化特征的检测参考文献[23]方法进行。

MALDI-TOF MS鉴定：菌株的MALDI-TOF MS鉴定参考文献[24]进行。

16S rDNA基因序列同源性分析：拮抗菌株16S rDNA序列的聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增及测定委托生工生物工程（上海）股份有限公司进行。16SrDNA基因序列进行BLAST比对，选取同源性较高的芽孢杆菌16S rDNA序列进行多序列匹配排列，利用MEGA 6.05软件构建系统进化树。

1.3.4 培养基质对拮抗菌株发酵液抗菌活性的影响

将分离菌株分别接种到装液量100 mL/250 mL的NB和PDW培养基中，37℃、150 r/min培养12 h制备种子液，取5 mL的种子液分别接种到装液量95 mL/250 mL的NB和PDW培养基，37℃、150 r/min培养，每隔12 h无菌操作取样进行生物量和抑菌效果的检测。

生物量的检测：通过测定发酵液在波长600 nm处的吸光度值（OD600nm）来反映菌体生物量[25]；抑菌效果的检测参考1.3.2方法。

2 结果与分析

2.1 拮抗菌株的分离与筛选

从采集的土样中共分离出10株细菌，以蜡样芽孢杆菌为指示菌株进行拮抗菌的筛选，分离菌株在NB培养基中上清液的抑菌效果见表1。由表1可知，10株分离菌株中有8株菌可测定出抑菌圈直径（DIZ），其中菌株LWM1的DIZ值最大（2.11 cm），表明其具有相对较强的抑菌作用，因此将菌株LWM1作为拮抗菌株进行下一步研究。

表1 分离菌株对蜡样芽孢杆菌的拮抗效果Table 1 Antagonistic effect of isolated strains onB.cereus

2.2 拮抗菌株培养及形态特征

菌株LWM1在NA和PDA平板上划线37℃培养24 h，观察其菌株形态特征，结果如图1所示。由图1可知，在NA平板上，菌株LWM1形成浅黄色不透明菌落，边缘不规则，表面粗糙；在PDA平板上，菌株LWM1菌落表面还呈现明显的褶皱状凸起，且菌落明显比在NA平板上的菌落大，表明PDA平板更适合菌株LWM1的生长。经芽孢染色后，菌体呈杆状，两端钝圆，芽孢圆柱状，多数为次端生，部分为中生，孢囊无膨大现象。

图1 菌株LWM1的菌落特征及菌体形态Fig.1 Colony characteristics and microbial morphology of strain LWM1

2.3 拮抗菌株的生理生化特征

菌株LWM1的生理生化特征检测结果如表2所示。由表2可知，菌株LWM1可利用蔗糖、麦芽糖、鼠李糖、山梨醇、蜜二糖、阿拉伯糖、七叶苷糖、淀粉、乳糖、木糖和半乳糖苷等碳源。过氧化氢酶和V-P实验阳性，甲基红和氧化酶实验阴性。经检索，菌株LWM1与解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）的生理生化特征高度相似[26]。

表2 菌株LWM1的生理生化特征检测结果Table 2 Detection results of physiological and biochemical characteristics of strain LWM1

2.4 拮抗菌株的MALDI-TOF MS鉴定

MALDI-TOF MS是一种基于检测细菌蛋白质指纹图谱的鉴定方法，具有简单快捷的优点，因此在微生物快速鉴定领域的应用越发广泛[24]。对菌株LWM1进行MALDI-TOF MS分析，蛋白质指纹图谱如图2所示。由图2可知，在2210m/z附近出现一个强度最大的的离子峰，而在3252、3856、4942、6 506、7 712和9 882 m/z附近出现的离子峰强度不大。检索后发现菌株LWM1与数据库中解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）的匹配分值为1.778。MALDI-TOF MS分值在1.700～1.999之间的结果仅可准确的鉴定到属[24]。因此，通过MALDI-TOF MS可将菌株LWM1鉴定为一株芽孢杆菌属（Bacillussp.）。

图2 菌株LWM1的MALDI-TOF MS质谱图Fig.2 Mass spectra of strain LWM1 by MALDI-TOF MS analysis

2.5 拮抗菌株16S rDNA基因序列同源性分析

菌株LWM1的16 S rDNA基因序列长度为1 503 bp，以一株副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）AB330933为外群，选取BLAST比对结果中同源性较高的15株菌构建进化树，结果如图3所示。由图3可知，菌株LWM1与解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）的多个菌株处于一个分支，进化距离较近。因此，结合菌株LWM1的形态观察、生理生化特性及MALDI-TOF MS鉴定结果，初步鉴定菌株LWM1为解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）。

图3 菌株LWM1基于16S rDNA序列的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree based on the 16S rDNA sequence of strain LWM1

2.6 不同发酵基质对抗菌活性的影响

分别选择PDW和NB培养基对菌株LWM1进行发酵培养，检测不同时间发酵液生物量和上清液的抑菌活性，结果如图4所示。由图4可知，菌株LWM1在2种培养基中均能快速生长，发酵24 h时，NB培养基中菌体生物量达到最高，OD600nm为1.796；PDW培养基中菌体生物量明显更高，发酵24 h时OD600nm为2.260，其后OD600nm逐渐升高，发酵48 h时生物量达到最高，OD600nm达到2.613，在发酵至72 h时仍保持较高的生物量。

图4 在PDW和NB培养基中菌株LWM1生物量和发酵上清液抑菌效果的比较Fig.4 Comparison of biomass and inhibition effect of the fermented supernatant fluid of strain LWM1 in PDW and NB medium

在NB培养基中，发酵12h时，50μL上清液DIZ为1.19cm，发酵24h时，DIZ达到最大值1.94cm，其后随发酵时间延长，DIZ逐渐减小；150 μL上清液抑菌活性也具有同样趋势，发酵24 h时具有最高抑菌活性，DIZ为2.19 cm。在PDW培养基中，发酵12 h时，50 μL上清液DIZ为1.31 cm，其后，DIZ逐渐变大，发酵60 h时，DIZ达到最大值2.11 cm；150 μL上清液在发酵24 h时DIZ从发酵12 h时的1.93 cm增至2.28 cm，在发酵24～60 h内均保持较高的抑菌活性，DIZ没有明显的增大现象。在同一发酵时间点，50 μL和150 μL的PDW上清液的抑菌活性均高于相对应的NB上清液。而且，在PDW培养基中，随发酵时间的延长，50 μL与150 μL的上清液抑菌活性的差距逐渐缩小，表明抑菌物质产生逐渐变大，结合菌株LWM1在PDW培养基中的生物量变化规律，可推测出相对廉价的PDW更有利于促进菌株LWM1生长和抑菌物质产生。

3 结论

本研究从土壤样品中分离出一株对食源性致病菌蜡样芽孢杆菌具有较强抑菌活性的菌株LWM1，经形态观察、生理生化试验、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱及16S rDNA基因序列同源性分析，菌株LWM1被初步鉴定为解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）。与NB培养基相比，菌株LWM1在PDW培养基中发酵上清液对蜡样芽孢杆菌具有更高的抑菌活性。PDW培养基成本相对较低，因此下一步可利用PDW培养基为主要底物进行发酵优化，获得最佳的抑菌物质产生工艺条件，通过大规模发酵制备和提取纯化拮抗蜡样芽孢杆菌的抑菌物质，并对抑菌物质作用条件、使用剂量及安全性能等方面进行探究和评估，从而获得一种廉价高效的抑菌剂。

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Isolation and identification ofBacillusLWM1 and its inhibition effect onBacillus cereus

ZHU Daheng1,LIU Li1,YU Rui1,ZHAO Ranran1,ZHU Lili1,CHENG Fang1,LIU Yusong1,WU Shijia1,ZHANG Li2,XI Yu1*
(1.School of Life Sciences,Zhengzhou University,Zhengzhou 450000,China; 2.College of Biological Engineering,Henan University of Technology,Zhengzhou 450002,China)

10 strains ofBacillusspp.were isolated from soil samples.UsingBacillus cereusas the indicator strain,strain LWM1 with strong antibacterial activity was isolated by Oxford cup diffusion method.Combined with morphological,physiological and biochemical tests,matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry(MALDI-TOF MS)and 16S rDNA gene sequence analysis,strain LWM1 was preliminarily identified asBacillus amyloliquefaciens.The inhibition effect of the fermented supernatant fluid of strain LWM1 in PDW and NB medium onBacillus cereuswas researched.The results showed that PDW medium was more favorable for the growth of strain LWM1 and the production of inhibitive substance.Therefore,the inhibitive substance of strain LWM1 could be prepared by large-scale fermentation with PDW medium as the main substrate.

Bacillusspp.;isolation;identification;antibacterial activity

Q815

0254-5071（2017）07-0027-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.07.007

2017-03-17

国家自然科学基金项目（31401918）；国家级大学生创新创业训练计划资助项目（201610459070）

朱大恒（1965-），男，教授，博士，研究方向为微生物发酵工程。

*通讯作者：席宇（1976-），男，讲师，硕士，研究方向为微生物发酵与优化。